Structural studies of regulatory protein domains involved in eukaryotic transcription

Olga Jasnovidova, M.Sc.

Disertační práce

Anotace:

RNA polymeráza II (RNAPII) je eukaryotický multidoménový enzym zodpovědný za transkripci genů kódujících a nekódujících proteiny. Jednou z domén RNAPII je flexibilní C-terminální doména (CTD), jež slouží k interakci se specifickými proteinovými faktory, které regulují transkripci. CTD se skládá z tandemových opakování konsenzuální sekvence tyrozin1-serine2-prolin3-threonin4-serine5- prolin6-serin7 (Y1S2P3T4S5P6S7). CTD je dynamickým způsobem post-translačně modifikována, čímž získává charakteristické interakční značky. Tyto značky jsou následně rozpoznávány specifickými faktory v souvislosti s fází transkripčního cyklu. Pochopení detailů, které určují interakce s CTD na molekulární úrovni je klíčové pro rozluštění funkce hustého regulačního systému při kontrole genové exprese. Předkládaná disertační práce je uvedena teoretickým přehledem struktury RNAPII a dosavadním mechanistickém poznání vlivu RNAPII na transkripční procesy. Úvod je doplněn shrnutím strukturních studií interakce CTD s různými faktory. Následuje popis biologických funkcí, které se pojí s CTD. Na příkladu interakcí CTD je diskutováno, jak si krátké a dlouhé neuspořádané řetězce v proteinech uchovávají spletitou regulační síť. Dále je analyzováno, jak různě fosforylované CTD-izoformy interagují s proteinovou rodinou CTD-interakčních domén (CID). Závěrečná část práce popisuje strukturní podstatu vytváření „coiled-coil“ domén a roli těchto „coiled-coil“ domén v co-transkripčních procesech. Experimentální práce je shrnuta ve dvou vědeckých článcích. První článek charakterizuje strukturní detaily rozpoznávání fosfo-threoninu – nové fosforylační značky na CTD – CID doménou proteinu Rtt103. Ve druhém článku je popsán integrativní strukturně-biologický přístup při studiu interakce dlouhého fragmentu CTD s terminačním faktorem Rtt103. Kombinací technik nukleární magnetické rezonance (NMR), rentgenové krystalografie (X-ray) a rentgenového rozptylu pod malými úhly (SAXS) jsou postupně určeny vysoce rozlišené struktury jednotlivých funkčních domén a jejich komplexů s CTD. Tyto jednotlivé strukturní fragmenty jsou nakonec seskládány dohromady, čímž je získána přesná představa o architektuře celého „makro“-komplexu. Naše výsledky poskytují vhled do molekulárního mechanismu regulace transkripce interakcemi mezi proteiny a CTD.

Abstract:

RNA polymerase II (RNAPII) is a eukaryotic multisubunit enzyme responsible for transcription of protein coding and non-coding genes. RNAPII uses its long and flexible C-terminal domain (CTD) to recruit specific protein/RNA-binding factors for regulation of transcription. The CTD consists of tandem repeats of the heptapeptide consensus tyrosine1-serine2-proline3-threonine4-serine5-proline6- serine7 (Y1S2P3T4S5P6S7). The CTD sequence is post-translationally modified in a dynamic manner, yielding specific patterns that are recognized by appropriate factors in coordination with the transcription cycle events. To determine how protein/RNA-binding factors assemble and exchange on the CTD of RNAPII has remained a major challenge. Revealing these molecular details is key to understanding of regulatory networks involved in the regulation of gene expression. The thesis begins with a theoretical overview of RNAPII structure and mechanistic knowledge behind the transcription process. Next, I introduce a biological functions connected to the CTD. Using CTD interactions as an example, I discuss, how short and long disordered regions in proteins maintain complicated regulatory networks. Further I analyze, how differently phosphorylated CTD isoforms are interacting with the family of CTD-interacting domains (CID). In the final part I describe a structural basis behind a formation of coiled-coil domains and a role of coiled-coil domains in co-transcriptional processes. The theoretical introduction is supplemented by a review, which summarizes structural studies about CTD interactions with various protein factors. To gain insights into the overall architecture of the CTD assembly, we set out to investigate how the CTD is decorated by the termination factor Rtt103. The study resulted in two research papers. In the first work we characterize structural details behind recognition of phospho-threonine, a new CTD phosphorylation mark, by CID of Rtt103p. In the second work we investigate how the CTD is decorated by the termination factor Rtt103p using the integrative approach of structural biology. There we combined NMR, X-ray crystallography, and small-angle X-ray scattering (SAXS) along with a divide-and-conquer approach in which structure of stable subunits of the complex are solved independently at a high resolution and are consequently used for the reconstruction of the overall architecture of the complex. Jointly our results give insights into the molecular mechanism of transcription regulation by CTD-Rtt103 interactions.

Keywords

Solution NMR, eukaryotic transcription, Cterminal domain of RNA polymerase II, protein-protein interactions, NMR v roztoku, transkripce u eukaryotických organismů, C-terminální doména RNA polymerázy II, protein-protein interakce

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 8. 2. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 1. 3. 2017
• Vedoucí: doc. Mgr. Richard Štefl, Ph.D.
• Oponent: Ing. Václav Veverka, Ph.D., Prof. Dr. Matthias Geyer

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Biomolekulární chemie