Nové mechanismy toxicity významných organických kontaminantů

Mgr. Martin Beníšek, Ph.D.

Doctoral thesis

New toxicity mechanisms of important organic contaminants

Abstract:

Environmentální kontaminanty mohou působit mnoha různými mechanismy toxicity. Tato práce se kromě známých mechanismů řízených přes arylhydrokarbonový receptor zaměřila hlavně na možný vliv xenobiotik na retinoidní signálování a buněčnou diferenciaci. Retinoidy jsou nesteroidní hormony důležité pro procesy vidění, embryonální vývoj, buněčnou diferenciaci a udržování homeostázy. Environmentální polutanty mohou působit na metabolismus retinoidů nebo na signální dráhy retinoidů a tak ovlivnit normální vývoj embrya a další procesy. Mezi látky známé působením na metabolismus a signálování retinoidů patří některé persistentní organické polutanty, polycyklické aromatické uhlovodíky (PAHs), ftaláty, pesticidy. Jak in vivo, tak in vitro účinky těchto a dalších environmentálních kontaminantů na retinoidní signálování, metabolismus a transport jsou shrnuty v článku II, který je součástí této práce. Pro náš výzkum byly použity in vitro buněčné modely, buněčná linie P19 a její klon P19/A15 s reportérovým genem, který je pod kontrolou retinoidních responsivních elementů. Studované environmentální kontaminanty byly 2,3,7,8,-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), ftaláty, PAHs a jejich dusíkaté heterocykly (N-PAHs). V první experimentální studii byly zjišťovány účinky TCDD a ftalátů. Ftaláty jsou běžně používaná změkčovadla a podobně jako TCDD jsou hojně rozšířené v životním prostředí. V našich testech s nediferencovanými buňkami P19/A15 tyto látky nevykazovaly významné účinky, avšak většina ftalátů snižovala genovou expresi řízenou kyselinou all-trans retinovou (ATRA) v diferencovaných buňkách P19/A15. TCDD potom slabě snižoval ATRA-řízenou genovou expresi u diferencovaných buněk P19/A15. Ve druhé studii bylo zkoumáno narušení retinoidního signálování PAHs a N-PAHs (látky široce rozšířené v životním prostředí). Mnoho z testovaných PAHs a N-PAHs vykazovalo účinky na ATRA-řízenou genovou expresi – snižování účinku, zvyšování účinku nebo dvoufázové účinky. Účinky vybraných PAHs a N-PAHs byly také potvrzeny pro několik koncentrací ATRA v koexpozici. V poslední části byly zjišťovány účinky vybraných PAHs a N-PAHs na buněčnou diferenciaci. Bylo zjištěno zvyšování a/nebo snižování hladin pluripotentního markeru Octameru-4 (Oct-4) u vybraných PAHs a N-PAHs v závislosti na čase expozice, což oboje může narušit normální diferenciaci. Ze studovaných látek se jako nejvíce účinné ukázaly fenantren a jeho analog 1,7-fenantrolin, zatímco benzo[a]antracen a jeho analog benzo[c]akridin měly jen slabé účinky na hladiny Oct-4. Závěrem lze říci, že některé environmentální kontaminanty (ftaláty, PAHs, N-PAHs) mohou významně ovlivňovat retinoidní signálování v in vitro experimentech s možnými důsledky v podmínkách in vivo. Studované účinné látky by tak mohly způsobovat embryotoxicitu a teratogenitu pomocí ovlivnění retinoidního signálování. Pro potvrzení těchto účinků jsou však nutné další experimenty, nejlépe in vivo.

Abstract:

Environmental contaminants can act through various toxicity mechanisms. This work is next to the well known and intensively studied mechanism mediated through aryl hydrocarbon receptor focused namely on the potential interference of xenobiotics with retinoid signaling and cellular differentiation. Retinoids are non-steroidal dietary hormones important especially for vision, embryonic development and tissue homeostasis. Environmental pollutants can affect either retinoid metabolism or signaling pathways of retinoids and thus influence normal development of embryo and other processes. Among pollutants known to affect retinoid metabolism and signaling belong several persistent organic pollutants, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), phthalates, pesticides and others. Important part of this work is detailed review of available information on in vitro and in vivo effects of environmental pollutants on retinoid signaling, metabolism and transport. For our research, pluripotent cell line P19 and its clone with reporter gene under the control of retinoic acid responsive elements (cell line P19/A15) were used as in vitro models. Studied environmental contaminants were 2,3,7,8,-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), phthalates, PAHs and their N-heterocyclic analogs (N-PAHs). In the first experimental study, effects of TCDD and phthalates were investigated. Phthalates are commonly used plasticizers and similarly to TCDD are widely present in the environment. While non significant effect was seen for these compounds in non-differentiated P19/A15 cells, most phthalates downregulated all-trans retinoic acid (ATRA) mediated gene expression in differentiated cells. TCDD weakly downregulated ATRA-mediated gene expression in differentiated P19/A15 cells. The second study investigated potential ability of PAHs and N-PAHs (pollutants ubiquitously present in the environment) to disrupt retinoid signaling. Many of tested PAHs and N-PAHs caused significant effects on ATRA-mediated response after 6 or 24h – downregulation, upregulation or biphasic effects. The effects of selected PAHs and N-PAHs were confirmed with several concentrations of ATRA in co-exposure. In the last part effects of selected PAHs and N-PAHs on cellular differentiation were studied. Downregulation and/or up-regulation of pluripotency marker Octamer-4, which can lead to disturbance in differentiation, were seen in these experiments for studied PAHs and N-PAHs depending on the duration of exposure. The most effective among studied compounds were phenanthrene and its analog 1,7-phenanthroline, while benz[a]anthracene and its analog benz[c]acridine had only weak effects on Oct-4 expression. In conclusion, several environmental contaminants (phthalates, PAHs, N-PAHs) had significant effects on retinoid signaling in in vitro experiments with possible impact for in vivo conditions. The effective compounds could thus possibly cause embryotoxicity or teratogenicity by disruption of retinoid signaling, however, further experiments in vivo are necessary to confirm these effects of studied compounds.

Keywords

retinoidy, polycyklické aromatické uhlovodíky, mechanismy toxicity, in vitro, retinoids, polycyclic aromatic hydrocarbons, toxicity mechanisms

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 3. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 2. 4. 2012
• Supervisor: doc. Mgr. Klára Hilscherová, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D., Dr. Margaret Murphy, Prof. Beate Escher

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry (4-years) / Environmental Chemistry