Stanovení vankomycinu metodou kapalinové chromatografie

Monika DOHNALOVÁ

Bachelor's thesis

Determination of vancomycin by liquid chromatographic method

Abstract:

Cílem této práce bylo verifikovat metodu kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí pro stanovení glykopeptidového antibiotika vankomycinu v pacientském séru a porovnat ji s metodou fluorescenční polarizační imunoanalýzy. Metoda kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí pro stanovení vankomycinu byla prováděna na vysokotlakém kapalinovém chromatografu Acouity UPLC s tandemovým hmotnostním detektorem Quatro Micro API a využívala mobilní fázi A a B, mobilní fáze A se skládá z 0,1% kyseliny mravenčí ve vodě a acetonitrilu (95:5) a mobilní fáze B se skládá z 0,1% kyseliny mravenčí v acetonitrilu a vodě (95:5) s průtokem 0,4 ml/min. Jako vnitřní standard byl použit tobramycin. Gradientová analýza každého vzorku probíhala 5 min při teplotě 30 °C v pozitivním ESI módu na koloně BEH C18 50 x 2,1 mm se zrněním 1,7 um. Metoda byla testována jako metoda s externím standardem. V rámci verifikace byla ověřena opakovatelnost, mezilehlá preciznost a pravdivost. Pravdivost stanovená metodou vnitřního a vnějšího standardu jako výtěžnost metody je 100,00 ? 106,20 %. Preciznost stanovená jako opakovatelnost je daná variačním koeficientem 2,83 ? 12,80 %, a jako mezilehlá preciznost s variačním koeficientem 6,20 ?10,97 %. Metoda byla ověřena proměřením 91 reálných pacientských vzorků v celém rozsahu kalibrace a statisticky porovnána s fluorescenční polarizační imunoanalýzou. Na základě statistického zpracování bylo zjištěno, že metody neposkytují shodné výsledky. Naměřené koncentrace vankomycinu metodou kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí jsou asi o 2 ? 11% vyšší než koncentrace naměřené fluorescenční polarizační imunoanalýzou a u dialyzovaných pacientů dokonce o 40 ? 70 % vyšší. Proto se v době dokončení bakalářské práce vyvíjí a testuje metoda s dalším interním standardem.

Abstract:

The aim of this study was to verify liquid chromatography method with tandem mass spectrometry for the determination of the glycopeptide antibiotic vancomycin in patient serum and compare it with the method of fluorescence polarization immunoassay. The liquid chromatography method with mass spectrometry for the determination of vancomycin was performed at the high pressure liquid chromatograph Acouity UPLC with tandem mass spectrometer Quattro Micro API and used of mobile phase A and B, mobile phase A consisting of 0,1% formic acid in water and acetonitrile (95:5) and mobile phase B consisting of 0,1% formic acid in acetonitrile and water (95:5) with a flow rate of 0,4 ml/min. As an internal standard was used tobramycin. Gradient analysis of each sample was carried out for 5 min at 30 °C in the positive ESI mode at the BEH C18 column 50 x 2,1 mm, 1,7 ?m. The method has been tested as a method with the external standard. In the context of verification repeatability, intermediate precision and trueness was measured. The trueness is 100,00 ? 106,20 % for both internal and external standard methods. The precision of the method determined as repeatability has coefficient of variation between 2,83 ? 12,80 % and as intermediate precision between 6,20 ? 10,97 %, respectively. The developed method was tested using 91 patient samples throughout the calibration range and statistically compared to the fluorescence polarization immunoassay. It was found that the methods do not provide identical results. Measured concentrations of vancomycin by liquid chromatography method with tandem mass spectrometry are about 2 ? 11% higher than concentrations measured by fluorescence polarization immunoassay and concentrations of dialysis patients are about 40 ? 70% higher. Therefore, the method will be further tested with another appropriate internal standard.

Keywords

glykopeptidová antibiotika, vankomycin, vysokoúčinná kapalinová chromatografie, fluorescenční polarizační imunoanalýza, validace a verifikace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 4. 2014

Accessible from:: 30. 4. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 4. 6. 2014
• Supervisor: RNDr. Hana Brozmanová, CSc.

University of Ostrava

Faculty of Medicine

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Health Laboratory Assistant