Příprava proteinů v umělých expresních systémech a analýza proteinových interakcí

Ing. Petr Yilma

Diplomová práce

Preparation of proteins by expression in artificial expression systems and analysis of protein interactions

Anotace:

Tato práce byla zaměřena na možnosti využití separačních chromatografických metod pro výrobu dvou konkrétních proteinů Air-2 (Aurora - Related serine\ threonine dinase) a Bir-1 (Baculovirus Inhibitory Repeat) z modelového organismu C.elegans. Proteiny byly identifikovány a následně bylo snahou prokázat vazebnou interakci mezi nimi. Sekvence genů Air-2 (Aurora - Related serine\ threonine dinase) a Bir-1 (Baculovirus Inhibitory Repeat) byla naklonována do speciálního expresního vektoru. Pro Air-2 byl použit pET 28 a pro Bir-1 vektor pGEX 2T. Tyto konstrukty umožní po transformaci do vhodných buněk (E.coli) expresi proteinu. Proteiny byly z buněk izolovány chemicky i mechanicky a následně identifikovány. Proteiny Air-2 a Bir-1 byly izolovány afinitní chromatografií a poté detegovány za použití nespecifických metod jako je barvení metodu Coomassie Brilliant blue nebo barvení stříbrem.V případě proteinu Bir-1 byla identifikace i hmotnostní spektrometrií. Dále byla u obu proteinů snaha prokázat vazebnou interakci mezi sebou.Tento experiment byl však ověřen pouze nespecifickou identifikaci.

Abstract:

This study was focused on the possibility of using seperative chromatographic methods for the processing of two particular proteins Air-2 (Aurora - Related serine\threonine dinase) and Bir-1 (Baculovirus Inhibitory Repeat) from the model organism C.elegans. The proteins were identified and then there was the effort to find the binding interaction between them. The sequence of the genes Air-2 and Bir-1 was cloned into the special express vector. pET 28 was used for Air-2 and for Bir-1 the vector was pGEX 2T. These constructs allow the expression of the protein after the transformation into the correct cells (E.coli). The proteins were isolated from the cells chemically and mechanically and then identified. The proteins Air-2 abd Bir-1 were isolated using affinity chromatography and thereafter detected using nonspecific methods such as colouring via the method Coomassie Brilliant Blue or Silver Staining. In the case of Bir-1 identification also occured by using mass spectrography. Furthermore we tried to demonstrate the binding interaction between both proteins, this experiment was however confirmed purely by nonspecific identification.

Klíčová slova

rekombinantní proteiny, afinitní chromatografie, interakce, detekce, MS analýza

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 26. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 31. 5. 2010
• Vedoucí: doc. Ing. Jan Fischer, CSc.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Chemie / Analytická chemie