Změny v podílu sialových kyselin v glykoproteinech spermií v průběhu in vitro kapacitace

Bc. Natálie Kalčicová

Diplomová práce

Changes in the portion of sialic acids in glycoproteins of spermatozoa during in vitro capacitation

Anotace:

Glykokalyx savčí spermie obsahuje sialové kyseliny. Sialová kyselina je sacharid, který má v reprodukci mnoho důležitých funkcí. Míra sializace je pro zralou spermii zásadní. Sializace buněčného povrchu chrání spermii před jejím rozpoznáním a odstraněním imunitním systémem uvnitř těla samice. Zároveň spermii udává negativní náboj, který výrazně ovlivňuje její strukturální vlastnosti. Sialové kyseliny mají vliv na motilitu spermií, mohou napomáhat spermiím procházet skrz cervikální mukus nebo se vázat na epitel oviduktu a tvořit oviduktální rezervoár spermií. Míra sializace u některých druhů hraje roli při rozpoznání a vazbě na zona pellucida oocytu. Množství sialových kyselin na povrchu spermie se v průběhu života spermie mění. Desializace povrchu spermie po kapacitaci byla potvrzena u několika savčích druhů. Cílem této diplomové práce bylo lokalizovat a detekovat sialoglykoproteiny na kančích spermiích před a po in vitro kapacitaci pomocí lektinů MAA, SNA, WGA a protilátek proti sialové kyselině. Pomocí nepřímé fluorescenční mikroskopie jsme pozorovali změny na apikální a hlavní části akrozomu, postakrozomální oblasti hlavičky a na bičíku spermií. Nejvýraznější změny jsme detekovali na bičíku, kde byl po kapacitaci signifikantní pokles signálu vazby lektinu MAA a pokles vazby lektinu SNA v suspenzi. Na akrozomu byl u vazby lektinů MAA a SNA detekován mírný nárůst počtu spermií se signálem pouze v apikální části akrozomu. U lektinu WGA byl naopak pozorován velmi malý pokles počtu spermií se signálem pouze v apikální části akrozomu. Změny byly detekovány i v postakrozomální oblasti na spermiích v suspenzi, kde byl u lektinu SNA pozorován 23% nárůst ve vazbě na spermie po kapacitaci, kdežto u vazby lektinu WGA byl pozorován naopak 68% pokles. Pomocí metody Western blot se nám podařilo detekovat sialoglykoproteiny v celkových a povrchových proteinových extraktech spermií. Signifikantní pokles v množství sialoglykoproteinů po kapacitaci na třetinu své původní hodnoty byl objeven u vazby lektinů MAA a SNA. Pomocí protilátky proti sialové kyselině jsme detekovali dva sialoglykoproteiny o podobné velikosti, u kterých jsme pozorovali pokles v množství po kapacitaci. Pomocí lektinů MAA, SNA a WGA jsme detekovali různé sialoglykoproteiny, u kterých jsme, až na jeden protein vázaný lektinem WGA, pozorovali pokles v množství po kapacitaci značící odstranění sialových kyselin nebo samotných proteinů ze spermií. Naše výsledky potvrzují, že po in vitro kapacitaci dochází k desializaci povrchu kančí spermie. Detekce sialové kyseliny zejména na bičíku spermie by tak mohla sloužit jako vhodný marker pro hodnocení kapacitace u kance. Výsledky našich experimentů dále poukazují na možnou redistribuci sialoglykoproteinů na akrozomu kančích spermiích po kapacitaci pro následnou vazbu na zona pellucida oocytu.

Abstract:

Mammalian sperm glycocalyx contains sialic acids. Sialic acid is a carbohydrate that has many important functions in reproduction. The level of sialylation is crucial for mature spermatozoa. Cell surface sialylation protects spermatozoa from its recognition and removal by the immune system within the female body. At the same time, sialic acid gives sperm a negative charge, which significantly affects its structural properties. Sialic acids affect sperm motility, can help sperm to pass through the cervical mucus, or to bind to the oviduct epithelium and form sperm oviductal reservoir. The level of sialylation in some species plays a role in the recognition and binding to the oocyte´s zona pellucida. The number of sialic acids on the sperm surface changes over the life of the sperm. Desialylation of the sperm surface after capacitation has been confirmed in several mammalian species. The aim of this diploma thesis was to localize and detect sialoglycoproteins on boar spermatozoa before and after in vitro capacitation using MAA, SNA, WGA lectins and sialic acid antibodies. Using indirect fluorescence microscopy, we observed changes in the apical region and anterior part of the acrosome, the post-acrosomal region of the head, and the tail of the sperm. We detected the most significant changes in the sperm tail. After capacitation, there was a significant decrease in the MAA lectin binding signal and a decrease in the SNA lectin binding signal in suspension. On the acrosome, a slight increase in sperm count with a signal was detected only in the apical part of the acrosome during the binding of MAA and SNA lectins. In contrast, WGA lectin showed a very small decrease in sperm count with a signal only in the apical part of the acrosome. Changes were also detected in the post-acrosomal region of sperm in suspension, where a 23% increase in the binding signal was observed for SNA on sperm after capacitation, while a 68% decrease was observed for WGA lectin binding. Using Western blotting, we were able to detect sialoglycoproteins in total and surface protein sperm extracts. A significant decrease in the number of sialoglycoproteins after capacitation to one-third of its original value was found in MAA and SNA lectin binding. Using a sialic acid antibody, we detected two sialoglycoproteins of similar size, in which we observed a decrease in the amount after capacitation. Using the MAA, SNA, and WGA lectins, we detected various sialoglycoproteins. Except for one WGA lectin-bound protein, we always detected a decrease in the amount after capacitation, indicating the removal of sialic acids or the proteins themselves from spermatozoa. Our results confirm desialylation of the boar sperm surface after in vitro capacitation. The detection of sialic acid, especially on the tail of sperm, could thus serve as a marker for the evaluation of capacitation in boars. The results of our experiments further indicate a possible redistribution of sialoglycoproteins on the boar sperm acrosome after capacitation for subsequent binding to the oocyte´s zona pellucida.

Klíčová slova

lektiny, kapacitace, glykoproteiny, sialová kyselina

Keywords

glycoproteins, lectins, capacitation, sialic acid

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 4. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie / Reprodukční biotechnologie