Elektrochemické biosenzory pro analýzu nukleotidových sekvencí a DNA-protein interakcí

Mgr. Jiří Červeň, Ph.D.

Disertační práce

Electrochemical biosensors for analysis of nucleotide sequences and DNA-protein interactions

Anotace:

V této disertační práci jsme se zaměřili na elektrochemické metody pro analýzu nukleotidových sekvencí a sledování interakce DNA s léčivy či proteiny. DNA-protein interakce hrají klíčovou roli v celé řadě buněčných procesů (regulace exprese genů, buněčného cyklu, opravy poškozené DNA atd.). Elektrochemické metody by se mohly stát alternativou či doplněním tradičně využívaných metod. Představují méně nákladný přístup při minimálně srovnatelné citlivosti. Sledování interakce DNA s léčivy je důležité především při vývoji nových léčiv. I tady mohou elektrochemické metody být vhodnou alternativou či doplněním. V experimentální části jsou popsány výsledky využití elektrochemických metod pro studování interakce DNA s wedelolaktonem. Tento coumestan je izolován z rostlin, které jsou využívány v tradičních medicínách pro léčbu septického šoku, zánětů. Bylo popsáno, že inhibuje topoisomerázu II, indukuje apoptózu u buněk rakoviny prostaty, vaječníku a prsu. Charakter jeho molekuly naznačuje, že by se wedelolakton mohl podobně jako jiný coumestan, coumestrol, interkalovat do DNA. Naše výsledky ukázaly, že s DNA interaguje relativně slabě a tato interakce není na bázi interkalace. V další části je popsáno značení DNA pomocí haptenu digoxigenu a detekce takto značené DNA pomocí konjugátu protilátky proti digoxigeninu s alkalickou fosfatázou. Tento přístup je důležitým krokem pro vytvoření univerzálního biosensoru jak pro analýzu nukleotidových sekvencí, tak pro detekci DNA-protein interakcí. V práci je popsána optimalizace detekci systému hapten-protilátka, možnost využití tohoto systému pro detekci hybridizace a PCR produktů. Poslední část práce je zaměřena na analýzu jiného typu DNA-protein interakce a to důsledek prodloužení řetězce DNA pomocí terminální deoxynukleotidyl transferázy. Metoda je založena na rozdílech v elektrochemických vlastnostech jednotlivých bazí DNA, na jejímž základě je možno sledovat připojení např. homoguanosylového úseku k primeru dA25. Práce zároveň řeší otázku tvorby alternativních struktur v prodlužovaných úsecích a jejich vliv na enzymovou reakci.

Abstract:

In this disertation thesis we focused on electrochemical methods for analysis of nucleotide sequences and studying of the interaction of DNA with proteins and drugs. DNA-protein interactions play key role in a lot of cellular processes (regulation of gene expression, cell cycle, DNA repair etc.). Electrochemical methods could become alternative or extension of traditionally used methods. They represent less expensive approach with at least comparable sensitivity. Monitoring of DNA-drug interactions is important mainly in new drug development, even in this field can electrochemical methods be useful alternative or addition. In experimental part we show results of using electrochemical methods for studying of the interaction of DNA with wedelolactone. This coumestan is isolated form plants that are used in traditional medicines for the treatment of septic shock or inflammation. It has been described that wedelolactone inhibits topoisomerase II and induces apoptosis in prostate, breast and ovarian cancer cells. The character of its molecule suggests that wedelolactone could be able to intercalate DNA molecules similarly as another coumestan, coumestrol. Our results show that interaction of wedelolactone with DNA is rather weak and that it is not based on intercalation. In the next part of the thesis DNA labeling with hapten digoxigenin and detection of labeled DNA using secondary antibody conjugated with alkaline phosphatase is described. This approach is important step for development of universal electrochemical biosensor for analysis of nucleotide sequences and DNA-protein interactions. In this thesis there is described optimalization of hapten-antibody detection system, and possibility of using hapten labeling for detection of hybridization and PCR products. The last part of the thesis is focused on analysis of a different type of DNA-protein interaction that is result of DNA tailing reaction. Method is based on differences in electrochemical properties of DNA bases. Based on this it is possible to monitor for example addition of homoguanosyl chain to dA25 primer. In this work formation of alternative structures in tailed chains and its influence on enzyme reaction is also studied.

Klíčová slova

DNA, DNA-protein interakce, interakce DNA s léčivy, Elektrochemie

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 28. 1. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 26. 2. 2016
• Vedoucí: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.
• Oponent: doc. Mgr. Václav Brázda, Ph.D., doc. Dr. Ing. Tomáš Navrátil

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Molekulární a buněčná biologie