Studium aktivity proteinu p53 u leukémií

RNDr. Jitka Malčíková, Ph.D.

Doctoral thesis

Study of the p53 protein activity in leukemia

Abstract:

Protein p53 je klíčovým regulátorem buněčného cyklu a apoptózy, který funguje jako ochrana buňky před genotoxickým a onkogenním stresem. Je ústřední bariérou proti nádorovému růstu, a proto bývá gen TP53 u malignit často poškozen, ve většině případů delecí jedné a mutací druhé alely. Ovšem již pouhá ztráta jedné alely výrazně predisponuje buňky k maligní transformaci, navíc proteiny nesoucí bodové mutace mohou získávat nové onkogenní vlastnosti. U chronické lymfocytární leukémie (CLL) mají abnormality v genu TP53 významný negativní vliv na prognózu. Vyskytují se s poměrně nízkou frekvencí (10-15 %), avšak u pacientů nereagujících na léčbu může frekvence dosahovat až 40%. Pacienti s těmito abnormalitami mají agresivní průběh onemocnění a jsou rezistentní na běžně používanou chemoterapeutickou léčbu, existují však nové léčebné strategie působící nezávisle na dráze p53. V běžné klinické praxi se stanovuje pouze přítomnost delecí genu a mutace obvykle nejsou vyšetřovány. Cílem dizertační práce bylo: 1) analyzovat mutace v genu TP53 u CLL pacientů a sledovat jejich asociaci s delecemi, jejich vliv na prognózu a souvislost jejich výskytu s aplikací chemoterapie; 2) studovat funkční vlastnosti p53 proteinů nesoucích různé mutace pomocí funkčních proteinových čipů. Podle získaných výsledků existuje u CLL výrazná asociace mezi delecemi a mutacemi genu TP53, avšak relativně velká část pacientů nese pouze mutace, zatímco samostatné delece se vyskytují ojediněle. Samostatné mutace mají významný negativní vliv na prognózu, jenž se významně neliší od pacientů s defekty v obou alelách. Mutace se mohou objevovat v průběhu onemocnění, na jejich selekci se významně podílí léčba a nově získané p53 defekty dále přispívají k agresivitě onemocnění. Mutační analýza genu TP53 by podle našich výsledků měla být standardní součástí vyšetření a měla by se provádět opakovaně, zejména před zahájením další léčby. Tímto se zvýší záchyt pacientů s rizikovým onemocněním potenciálně rezistentních na chemoterapii. Z funkčních studií p53 mutovaných proteinů vyplynulo, že funkční proteinové čipy jsou vhodné k rychlému porovnání vlastností mnoha proteinů zároveň, avšak data získaná z in vitro experimentů nemusí vždy odrážet skutečnou situaci v buňce. C-koncový mutant, který vykazoval nejvyšší vazbu k DNA na čipu, měl pouze částečně zachované transaktivační schopnosti v reportérových genových testech a téměř nulovou schopnost aktivovat transkripci endogenních cílových genů. Samotná vazba k DNA tedy není vždy dostatečná k zajištění transaktivačních schopností. Jelikož narušení funkce může být daleko závažnější, než ukazují mechanistické in vitro studie, je třeba výsledky vždy ověřit v buněčném kontextu.

Abstract:

The p53 protein is a key cell cycle regulator that protects cells from genotoxic and oncogenic stress. It plays a crucial role in preventing cancer development. Thus, the TP53 gene is often impaired in cancer cells, usually by deletion of one and mutation of the other allele. However, even the loss of one allele predisposes the cell to malignant transformation and p53 proteins with missense mutations can adopt novel oncogenic properties. In chronic lymphocytic leukemia (CLL) the TP53 abnormalities are of a high prognostic impact, they occur with a low frequency (10-15 %); however, in patients with refractory disease the frequency may reach 40%. Patients with defects of p53 suffer from aggressive disease and are often resistant to standard chemotherapy. Novel therapeutic approaches acting independently on the p53 pathway are recently available. Only deletions of the TP53 gene are currently examined in clinical setting and mutations are not usually routinely detected. The aim of the dissertation was: 1) to analyze the mutations of the TP53 gene in CLL patients and to asses their association with deletions, their prognostic impact and relation to therapy application; and 2) to study the functional properties of p53 proteins with different mutations by functional protein microarrays. Our results show a high association between presence of mutations and deletions in the TP53 gene. However, relatively large cohort of patients bears only mutations, while separate deletions are very rare. Separate mutations have negative impact on patients´ survival that is not significantly different from patients with both alleles affected. Mutations can occur during the course of the disease, therapy plays an important role in their selection and novel p53 defects further contribute to disease aggressivity. Our results therefore suggest the importance of the TP53 mutational status investigation that should be performed repeatedly especially before initialization of second and further therapies. Therefore, patients that are at risk of refractory disease should not have been omitted. We have shown that functional microarrays are reliable for fast screening of multiple protein properties in parallel. However, the data from these in vitro approaches may not always reflect the situation in the cell. C-terminal mutant that exerted the highest DNA binding on the array showed only a partial activation in the reporter gene assay and almost no activation of endogenous downstream target genes. The DNA binding itself is not sufficient for effective activation of the p53 target genes. The in vivo functional impairment may be therefore more fatal in comparison to what implies from in vitro experiments and studies within the intact cellular context are advisable.

Keywords

DNA-vazebná aktivita, chronická lymfocytární leukémie, mutace, prognostické faktory, p53, transaktivace/DNA-binding activity, chronic lymphocytic leukemia, mutation, prognostic factors, transactivation

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 9. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 23. 10. 2009
• Supervisor: prof. RNDr. Jan Šmarda, CSc.
• Reader: RNDr. Eva Roubalová, Ph.D., RNDr. Eva Macháčková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology