Strukturní a interakční vlastnosti 14-3-3 proteinu v monomerním stavu

Bc. Alexandra Náplavová

Master's thesis

Structural and interaction properties of 14-3-3 proteins in the monomeric state

Abstract:

14-3-3 proteiny jsou klíčové buněčné regulátory exprimované napříč eukaryotami. Bylo prokázáno jejich zapojení do široké škály buněčných jevů, včetně kontroly buněčného cyklu, migrace a řízení buněčné smrti. Pro správnou funkci 14-3-3 je důležitý jejich typický dimerní charakter, široce zdokumentovaný v literatuře. Po fosforylaci na serinu 58 (14-3-3 pS58) byl ovšem pozorován rozpad na monomerní podjednotky - to může představovat mechanismus regulace samotných 14-3-3. Jelikož příprava čistého fosforylovaného proteinu byla zoptimalizována teprve nedávno, studie popisující jeho interakce a strukturu nad rámec oligomerního charakteru dosud chybí. Tato diplomová práce klade tedy důraz na ustanovení metodologie pro zkoumání právě monomerního 14-3-3. Pro tento účel byl zoptimalizován protokol pro fluorinové značení 14-3-3 proteinů, jejich následnou fosforylaci a ověřeno zachování funkčnosti po inkorporaci fluoru. S využitím 19F nukleární magnetické resonanční spektroskopie byly následně prozkoumány dynamické, interakční i strukturní charakteristiky monomerního 14-3-3 pS58 a široce porovnány s vlastnostmi 14-3-3 dimeru. V neposlední řadě byla ověřena možnost krystalizace monomerního 14-3-3, za účelem potenciálního vyřešení struktury rentgenovou difrakcí.

Abstract:

The 14-3-3 protein family members are crucial cell regulators ubiquitous in eukaryotic cells. Their connection to the broad range of cellular processes was established, linking 14-3-3s to cell cycle control, cell migration or cell-death regulation. For the 14-3-3’s proper function, their typical dimeric character is essential, characterized heavily across literature. However, after phosphorylation at Ser58 (14-3-3 pS58) dissociation to monomers was observed - hinting at the possible regulation mechanism for 14-3-3s. As the preparation of pure phosphorylated 14-3-3 was optimised only recently, the studies describing monomer’s interaction and structure beyond oligomeric state are lacking. This diploma thesis thus aims to establish methodology for study of the monomeric 14-3-3. For this purpose, the protocol for fluorine labelling of 14-3-3s was optimised, including follow-up phosphorylation and verification of functionality after fluorine incorporation. Exploiting 19F nuclear magnetic resonance spectroscopy the dynamic, interaction and structural characteristics of monomeric 14-3-3 pS58 were explored and thoroughly compared to that of the 14-3-3 dimer. Furthermore, the possibility of 14-3-3 monomer crystallization was tested, for potential structure determination via X-ray diffraction.

Keywords

14-3-3, nukleární magnetická rezonance, 19F NMR, značení proteinů, fosforylace 14-3-3, oligomerizace, krystalizace, nuclear magnetic resonance, protein labelling, 14-3-3 phosphorylation, oligomerization, crystallization

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 5. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 20. 6. 2023
• Supervisor: doc. RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.
• Reader: Mgr. Radka Dopitová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biomolecular chemistry