Mechanismus odpovědi na hypoxii u embryonálních kmenových buněk

Bc. Julie Musilová

Master's thesis

Mechanism of hypoxia response in embryonic stem cells

Abstract:

Tato práce se zabývá studiem mechanismu odpovědi myších embryonálních kmenových buněk na hypoxii. Ke studiu byl využitý model, který se snaží s pomocí farmakologických látek simulovat v normoxii stav buněk typický pro nedostatek kyslíku. To obnáší stabilizaci faktoru indukovaného hypoxií, který je považován za klíčovou složku odpovědi na hypoxii a který spouští transkripci řady genů souvisejících s adaptací na nedostatek kyslíku. Dále pak dodání nebo indukci tvorby reaktivních metabolitů kyslíku, jejichž působení během hypoxie je také velice diskutováno. Zájem byl kladen na pozorování změn v signálních drahách významných pro zachování typických vlastností myších embryonálních kmenových buněk. Ke stanovení snášenlivosti používaných látek byla použita ATPázová assay. Pro detekci přítomnosti reaktivních metabolitů kyslíku v buňkách byla použita fluorescenčně značená sonda a následné stanovení na průtokovém cytometru. K detekci stabilizace hypoxií indukovaného faktoru a fosforylací molekul studovaných signálních drah byla použita metoda western blot. Z výsledků práce vyplývá, že stabilizace hypoxií indukovaného faktoru a působení reaktivních metabolitů kyslíku nejsou pravděpodobně jediné zásadní faktory ovlivňující odpověď buňky na nedostatek kyslíku. Odhalení dalšího faktoru je otázkou dalšího studia.

Abstract:

In this thesis we study mechanism of response of mouse embryonic stem cells to hypoxia. To simulate hypoxic state of cells under normoxic conditions we have used a farmacological model, which includes stabilization of hypoxia-inducible factor, the key regulator in cell response to hypoxia, by mimetics. HIF is transcriptional factor which triggers transcription of many genes, responsible for adaptation to oxygen deficiency. The role of reactive oxygen species during hypoxia is also discussed. We used exogenic and endogenic sources of reactive oxygen species. We tested an influence of HIF, ROS and their combination on cell signalling. We focused on monitoring of changes in signalling pathways, important for pluripotency and self-renewal of mouse embryonic stem cells. ATPase assay was used for testing viability of cells after treatment with drugs. Production of reactive oxygen species was detected by flow cytometry. Western blot was used for detection of stabilization of hypoxia-inducible factor-1α and fosforylations of studied molecules. The results show that stabilization of hypoxia-inducible factor-1α and influence of reactive oxygen species are not suffiecient to simulate hypoxic state observed during real hypoxia. Other factors are waiting for recovering.

Keywords

HIF, hypoxie, ERK, ROS, Akt, proliferace, embryonální kmenové buňky, diferenciace, sebeobnova, pluripotence, hypoxia, proliferation, embryonic stem cells, diferentiation, self-renewal, pluripotency

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 4. 6. 2014
• Supervisor: Mgr. Jiří Pacherník, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Special Biology