Úloha Skp2 v cytokinetice nádorových kmenových buněk

Mgr. Šárka Šimečková, Ph.D.

Doctoral thesis

Role of Skp2 in cytokinetics of cancer stem cells

Abstract:

Nádor je abnormální tkáň, která se skládá z různých buněčných typů. Samotné nádorové buňky jsou různorodé. K heterogenitě nádorové tkáně přispívají nádorové kmenové buňky (NKB) a proces epiteliálně mesenchymálního přechodu (EMT). Úloha NKB i EMT ve vývoji rakoviny prostaty již byla prokázána. Mimo to byla popsána souvislost mezi ziskem mesenchymálního fenotypu a fenotypu NKB u nádorových buněk prostaty. I když NKB tvoří jen malou populaci buněk v nádoru, byla popsána jejich rezistence k terapeutikům a jejich podíl na heterogenitě nádoru, a proto představují zajímavý cíl pro protinádorovou terapii. S-phase kinase-associated protein 2 (Skp2) je onkogen, jehož zvýšená hladina byla popsána u mnoha nádorových onemocnění včetně rakoviny prostaty. Skp2 se podílí na řízení cytokinetiky - buněčných procesů zahrnujících buněčný cyklus, apoptózu či diferenciaci. Jelikož funkce Skp2 u NKB není stále dobře známá, zaměřili jsme se na úlohu Skp2 u NKB prostaty. Výsledky prezentované v předkládané disertační práci ukazují, že zvýšená jaderná hladina Skp2 a mesenchymální fenotyp buněk koreluje s vyšším Gleasonovým skóre pacientů. V in vitro podmínkách jsme pozorovali zvýšenou hladinu Skp2 u buněk s mezenchymálním fenotypem, které navíc vykazovaly znaky typické pro NKB. Snížení hladiny Skp2 v buňkách naopak vedlo ke zvýšení četnosti buněk pozitivních na znaky CD24 a CD44. Ukázali jsme, že u pacientů s rakovinou prostaty je zvýšená hladina těchto znaků spojena s příznivou prognózou bez recidivy. Farmakologická inhibice komplexu SCFSkp2 vedla k zástavě buněčného cyklu, způsobila buněčnou smrt u CD24+ buněk a snížila klonogenní kapacitu buněk kultivovaných ve 2D podmínkách. Naším dalším cílem bylo ustanovit metodu, pomocí které bychom byli schopni komplexně vyšetřit buněčnou odpověď na působení terapeutik i u malých populací buněk (např. NKB) v heterogenních vzorcích. Průtoková cytometrie, která byla za tímto účelem použita, umožňuje vyšetřit sedm parametrů na úrovni jedné buňky a může tak přinést více informací o odpovědi specifických buněk ve vzorku. Výsledky prezentované v této práci tedy souhrnně popisují asociaci proteinu Skp2 s horší prognózou pacientů s rakovinou prostaty a spojitost s mezenchymálním fenotypem buněk, který je dále spjat s fenotypem NKB prostaty. Snížení hladiny Skp2 nebo farmakologická inhibice SCFSkp2 vedla k ovlivnění těchto vlastností a ke změně jejich fenotypu. Dále jsme popsali zavedení účinné cytometrické metody ke sledování komplexní odpovědi buněk s definovaným fenotypem na experimentální působení protinádorové terapie.

Abstract:

A tumour is recognized as a neoplastic tissue consisting of various cell types and a substantial degree of heterogeneity is found in a tumour mass within cancer cells. Well accepted concepts contributing to such heterogeneity and tumour plasticity are cancer stem cells (CSCs) and the process of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). Both CSCs and EMT were shown to be involved in prostate cancer (PCa) progression. Moreover, the acquisition of a mesenchymal phenotype causing appearance of CSC-like characteristics in PCa was described. Since the CSCs are described as a subpopulation within a tumour that is responsible for tumour heterogeneity and drug resistance, they represent an attractive target for anticancer therapy. S-phase kinase-associated protein 2 (Skp2) was previously described as an oncogene and its overexpression was detected in various cancers including PCa. It is involved in the regulation of cytokinetics - processes encompassing cell cycle, apoptosis, and differentiation. However, the role of Skp2 in CSCs is not well described yet. Thus, in our study, we focused on the role of Skp2 in prostate CSCs. We found that high nuclear expression of Skp2 and mesenchymal phenotype correlated with high Gleason score in PCa patients. In vitro, increased Skp2 expression was observed in PCa cell lines with mesenchymal and CSC-like phenotype compared to their epithelial counterparts. Conversely, the CSC-like phenotype was less represented in cells, in which SKP2 expression was silenced. Furthermore, we observed that Skp2 downregulation led to increased expression of CSCs markers CD24 and CD44. Additionally, we showed that high expression levels of both CD24 and CD44 was associated with favourable recurrence-free survival for PCa patients. Pharmacological inhibition of SCFSkp2 activity resulted in cell cycle arrest, induced late apoptosis in CD24+ cells, and affected the clonogenic ability of single cells in 2D condition. The importance of complex analysis of cellular response to experimental treatments in samples with a limited number of cells (e.g., rare populations like CSCs) prompted us to establish a multiparametric flow cytometric assay. This facilitates the complex analysis of cellular phenotype-dependent response to an experimental treatment on a single cell level. Herein, we describe a seven-parameter flow cytometric assay that could complement routine cell-based tests and bring valuable information to the analysis of complex cellular response in phenotypically characterized cell populations. In this thesis, we propose that high expression of Skp2 is associated with mesenchymal phenotype concomitant with the CSCs-like characteristics of the cells. Skp2 downregulation or pharmacological inhibition of SCFSkp2 affect cancer CSCs-like properties and change surface expression of CSC markers. Furthermore, we introduce a powerful flow cytometric assay for complex analysis of cellular phenotype after anti-cancer treatments that enables to distinguish a response of a small subset of cells defined by CD surface antigens within heterogeneous samples.

Keywords

Rakovina prostaty, nádorové kmenové buňky, mnohoparametrická průtoková cytometrie, Prostate cancer, cancer stem cells, Skp2, MLN-4924, multiparametric flow cytometry

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 9. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 18. 10. 2018
• Supervisor: Mgr. Karel Souček, Ph.D.
• Reader: RNDr. Petr Vaňhara, Ph.D., Mgr. Radek Jorda, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology