Analýza molekulárních mechanismů podmiňujících reakci lidských embryonálních kmenových buněk na poškození DNA

Bc. Tomáš Bárta, Ph.D.

Master's thesis

Analysis of molecular mechanism underlying reaction of human embryonic stem cells to DNA damage

Abstract:

V somatických buňkách jsou v průběhu buněčného cyklu strategicky rozmístěny kontrolní body, které zajišťují integritu genomu. Regulace kontrolních bodů a buněčného cyklu v embryonálních kmenových buňkách se liší od regulace v diferencovaných somatických buňkách. Cílem této studie bylo zjistit, zda hES buňky obsahují molekulární komponenty zapojené do ATM/ATR signalizace a zda mají plně vyvinuty a funkční G1/S a G2/M kontrolní body. V této studii jsem stanovil efekt různých dávek UVC záření na hES buňky. Zjistil jsem, že poškození DNA v G1 fázi způsobuje akumulaci hES buněk v G1/S fázi buněčného cyklu, což naznačuje přítomnost G1/S kontrolního bodu. CDK2 a její aktivační fosfatáza Cdc25A jsou klíčové molekuly, které jsou odpovědné za blok v G1/S kontrolním bodu. Při poškození DNA (UVC ≥ 1.5 J/m2) dochází k rychlé degradaci Cdc25A a snížení aktivity CDK2 i CDK1. Western blottingová analýza ukázala, že krátkodobě in vitro propagované hES buňky jsou náchylnější k UVC záření a aktivují apoptické dráhy při nižších dávkách UVC než hES buňky dlouhodobě in vitro propagované a diferencované hES buňky. Nediferencované hES buňky aktivují stresové dráhy p38 a p53, které jsou funkčně zapojeny do regulace kontrolních bodů buněčného cyklu. Předkládaná diplomová práce přispívá k pochopení regulace stresových drah zapojených do aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu u hES buněk. K detailnějšímu pochopení mechanismu regulace kontrolních bodů u hES buněk je zapotřebí provést podrobnější analýzu stresových drah.

Abstract:

In somatic cells the checkpoint pathways are strategically placed to protect the genom integrity. Cell cycle regulatory pathways in early embryos differ significantly from those in differentiated somatic cells. The aim of this study was to determine whether hESC contain molecular components involved in ATM/ATR signaling pathways and also whether their G1/S and/or G2/M checkpoints are developed and fully functional. As the regulation of ATM/ATR pathways is dependent on the type and the extent of DNA damage, here I studied the effect of different doses of UVC irradiation on hESC. I found that DNA damage in early G1 phase causes cell cycle arrest of hES cells in G1/S phase, suggesting the presence of G1/S checkpoint pathway. CDK2 and its upstream regulatory molecule Cdc25A are the crucial molecules that drive cell through G1/S transition. I found that Cdc25A phosphatase becomes degraded and activity of CDK2 is lowered at doses of UVC ≥ 1.5 J/m2. Moreover, western blot analysis showed that hESC at doses of UVC ≥ 1 J/m2 undergo apoptosis and activate stress pathways involving p38 and p53, which are functionally connected with ATM/ATR. In contrast to hES cells, differentiated and somatic cells do not activate these pathways in response to UVC irradiation. This study shows that hESC can activate stress pathways involved in checkpoint activation. It will be necessary to provide further detailed study of checkpoint activation in hESC.

Keywords

hES, lidské embryonální kmenové buňky, buněčný cyklus, poškození DNA, kontrolní bod, Cdc25A, Cdc25C, Chk1, Chk2, p53, PARP, p38, záření, UVC, G1, G2, S

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 16. 6. 2008
• Supervisor: doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular Biology and Genetics