Nové možnosti v kardiomyogenní diferenciaci pluripotentních kmenových buněk

Katarzyna Anna Radaszkiewicz, M.Sc.

Doctoral thesis

New options in cardiomyogenic differentiation of pluripotent stem cells

Abstract:

Lidské srdce je orgán s nejmenší schopnotí regenerace. Schopnost obnovy kardiomyocytů je tak omezená, že většina kardiomyocytů není během života nikdy nahrazena novými. Také se odhaduje , že v důsledku infarktu myokardu může odumřít až jedna miliarda kardiomyocytů z přibližně čtyř miliard, které jsou součástí levé komory. Současné terapeutické možnosti sice pomáhají zmírnit následky takového poškození, ale nejsou schopné zajistit jeho nápravu. Cílem dnešní medicíny je tak najít možností, jak tyto ztracené kardiomyocyty nahradit novými. Proto se základní biomedicínský výzkum zaměřuje na hledání nových možností pro takovou terapii. Pluripotentní kmenové buňky jsou zajímavým a prakticky neomezeným zdrojem kardiomyocytů pro medicínské aplikace, včetně modelování onemocnění nebo testování farmak. K dnešnímu dni existuje několik protokolů, jak z pluripotentních kmenových buněk připravit kardiomyocyty. Přesto stálé zůstávají nevyřešené některé následující otázky. Jak zvýšit výtěžnost těchto protokolů, jak přípravit čistou populaci kardiomyocytů a jejich subtypů, jak připravit progenitory kardiomyocytů, a to vše tak, aby mohly být použity pro opravu poškozeného srdce. Studium kardiomyogeneze u pluripotentních kmenových buněk in vitro nám umožňuje vylepšit tyo techniky jejich diferenciace. Proto jsme studovali, jak i malé změny v diferenciačním protokolu, mohou ovlivnit tvorbu kardiomyocytů. Zde jsme ukázali, že zkrácení fáze tzv. embryoidních tělísek a odstranění séra indukuje maturaci vznikajících kardiomyocytů, ale ne jejich počet. Současně jsme ukázali, že pro přesné určení fenotypu, počtu a případně i zralosti kardiomyocytů, je důležité použití více metod. S ohledem na tato fakta, jsme vyvinuli a validovali software CB Analyser (Cardiomyocyte Beating Analyser) pro automatickou a neinvazivní analýzu frekvence a rychlosti kontrakce u kardiomyocytů, jedné z jejich základních charakteristik. Dále jsme studovali vliv hypoxie na kardiomyogenezi in vitro. Embryonální vývoj probíhá za snížené dostupnosti kyslíku, což hraje klíčovou úlohu v regulaci osudu kardiomyocytů. Z našich výsledků plyne, že krátkodobá expozice vyvíjejících se kardiomyocytů hypoxii, u nich vede k indukci fenotypu komorových kardiomyocytů. Naproti tomu, jejich dlouhodobá expozice hypoxii významně podporuje nárůst počtu vznikajících kardiomyocytů. Pozorované efekty byly závislé na přítomnosti transkripčního faktoru HIF1, což potvrzuje význam tohoto faktoru pro kardiomyogenezi. Na rozdíl od embryonálního, dospělé srdce vyžaduje intenzivní zásobení kyslíkem. V případě patologických stavů doprovázených hypoxickým stresem, se srdce brání tzv. fetálním reprogramováním, které podporuje přežívání kardiomyocytů. Zde jsme ukázali, že změna exprese genu pro těžký řetězec myozinu beta, které je indukována hypoxií, je řízena transkripčním faktorem HIF1. Zabývali jsme se také modulací kardiomyogeneze pomocí tzv. malých molekul. Vycházeli jsme z faktu, že osud buněk jako je jejich diferenciace a proliferace je možno řídit syntetickými látkami, které regulují příslušné kaskády buněčné signalizace. Zde jsme ukázali, že u embryonální kmenových buněk je silným induktorem kardiomyogeneze 12-O-Tetracanoylphorbol-13-acetate (TPA). V souhrnu, naše výsledky tak ukazují nové možnosti v regulaci diferenciace pluripotentních buněk do kardiomyocytů a rozšiřují naše znalosti o tomto procesu. Jsme tak o krok blíže k účinné tvorbě kardiomyocytů z pluripotentních buněk pro další aplikace.

Abstract:

Human heart is one of the least regenerative organs in our body. The renewal rate in myocardium is so low that most cardiomyocytes will never be replaced during normal life span. The human left ventricle heart consists of approximately 4 billion cardiomyocytes and one-quarter of these cells is lost during typical infarct. Current standard therapies can slow down the progression of heart diseases, but fail to reverse it. One of aims in medicine is to replace damaged heart tissue by new cardiomyocytes. Therefore, basic biological studies are needed to deliver new options for modern therapies. Pluripotent stem cells represent an attractive, nearly unlimited source of cardiomyocytes for medical application, disease modelling and drug discovery. Nowadays a number of robust protocols for cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells is available. However, still many aspects need to be addressed - generation of sufficient quantities of functional cells, derivation of pure population of specific cardiac subtypes or formation of cardiovascular progenitors, which may settle and regenerate damage heart. Extension of our knowledge about cardiomyogenesis in vitro can improve pluripotent stem cells differentiation strategies. Therefore, we examined how minor manipulations in the standard protocol of embryonic stem cells differentiation influence cardiac formation. We showed that shorten period of EBs cultivation in non-adherent condition and serum withdrawal accelerate cardiomyogenesis, improve maturation of cells but do not increase cardiac number. Moreover, we demonstrated the importance of different methods application for proper determination of cardiomyocytes phenotype, yield and maturity. With this intention we developed and validated software named CB Analyser (Cardiomyocyte Beating Analyser) for the automated and non-invasive quantification of the frequency and duration of the contraction- the most distinctive feature of cardiac cells. We also analysed role of hypoxia in cardiomyogenesis in vitro. Embryonic development undergoes under low oxygen level and this condition plays crucial role in regulation of cardiac fate. Our results indicated that short hypoxic exposure during embryonic stem cells differentiation propagates formation of ventricular-like cardiomyocytes, whereas long hypoxic treatment significantly increases yield of cardiomyocytes. These observations are HIF1 dependent, highlighting importance of this transcription factor in cardiomyogenesis. In contrast to embryonic, adult heart function is extremely dependent on oxygen supply. A common response to hypoxic stress, effect of pathopsychological states, relays on induction of fetal gene reprogramming to support cell survival. Here, we reported that changes in the expression of genes encoding myosin heavy chains, in response to hypoxic condition, are HIF1 dependent. Finally, we investigated role of small molecules in cardiomyogenesis. Cell fate decision can be directed by chemically synthesized factors recapitulating signalling involved in cell differentiation process. We demonstrated that 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) is a potent inducer of cardiac formation in embryonic stem cells. Our data unlock new opportunities for cardiac differentiation and extend our knowledge about this process. We are one step closer to the development of efficient, well controlled and reliable methods of PSC derived cardiomyocytes generation for various purposes.

Keywords

embryonic stem cell, cardiomyogenesis, hypoxia, embryonální kmenové buňky, kardiomyogeneze, hypoxie

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 3. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 27. 4. 2018
• Supervisor: Mgr. Jiří Pacherník, Ph.D.
• Reader: Giancarlo Forte, Ph.D., prof. MUDr. David Sedmera, DSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology