Elektrochemické metody pro detekci interakcí DNA s proteiny a pro sledování enzymatických přeměn DNA

Mgr. Monika Hermanová, Ph.D.

Disertační práce

Electrochemical methods for detection of DNA-protein interactions and for monitoring of DNA enzymatic processing

Anotace:

V této práci představujeme tři nové aplikace využívající elektrochemii DNA a redoxní značení DNA. Elektrochemické signály, které poskytuje DNA, jsou založeny buď na redoxní aktivitě bází DNA, v důsledku které můžeme pozorovat píky CA a G na rtuťových elektrodách a píky G a A na uhlíkových elektrodách, nebo na adsorpčně-desorpčních jevech a reorientaci DNA na povrchu elektrody, které můžeme sledovat prostřednictvím tenzametrických píků na rtuťových elektrodách. Další možnost pro využití elektrochemických metod ke studiu DNA představuje redoxní značení DNA, kterého může být dosaženo například pomocí kovalentně se vázajících značek, jako jsou komplexy oxidu osmičelého, nebo pomocí enzymatické inkorporace modifikovaných nukleobází do DNA. Značení DNA prostřednictvím enzymatické inkorporace redoxních značek do DNA bylo využito v nové metodě pro detekci interakcí proteinů s DNA. Tato metoda je založena na duálním značení DNA sond s využitím dvou různých elektroaktivních značek, které poskytují redukční píky při odlišných potenciálech a umožňují tak detekci vazby proteinu na značené sondy v kompetičním upořádání. S použitím tohoto přístupu bylo možné rozlišit sekvenčně specifickou a nespecifickou vazbu proteinu p53 na DNA, jelikož protein p53 vykazoval silnou preferenci pro sondy obsahující specifickou vazebnou sekvenci pro protein p53 (p53CON). Detekce DNA pomocí jejích vlastních signálů byla využita pro studium syntézy jednořetězcových úseků DNA katalyzované terminální deoxynukleotidyl transferázou (TdT). Zjistili jsme, že elektrochemická detekce může být úspěšně použita pro sledování této reakce. Obzvláště elektroda z pyrolytického grafitu se ukázala jako velmi vhodná pro pozoruhodně přesné určení délky produktů reakce. Na druhou stranu, visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) odhalila tvorbu různých struktur DNA, jako jsou vlásenky nebo G-kvadruplexy, které ovlivňují chování molekul DNA na negativně nabitém povrchu HMDE a také průběh syntézy DNA katalyzované TdT. Modifikace s využitím komplexu oxidu osmičelého byla uplatněna v nové dvoukrokové technice modifikace DNA, která spočívala v enzymatické konstrukci DNA nesoucí butylakrylátové (BA) skupiny a následné modifikaci reaktivní dvojné vazby C=C v akrylátovém zbytku. Tento přístup umožnil modifikaci BA jak v jednořetězcové, tak dvouřetězcové DNA i za podmínek, za kterých modifikace bází v dvouřetězcové DNA neprobíhá.

Abstract:

Three novel applications of DNA electrochemistry and redox DNA labeling are presented. Electrochemical signals of DNA are based either on redox activity of DNA bases, which can be observed as CA and G peak at mercury electrodes and G and A peak at carbon electrodes or on adsorption/desorption and reorientation processes which can be observed as tensammetric peaks at mercury electrodes. Another option for studying DNA using electrochemical methods lies in its redox labeling, which can be achieved using covalently bound labels, such as osmium tetroxide complexes, or by enzymatic incorporation of modified nucleobases into DNA. Redox labeling of DNA via enzymatic incorporation was used in development of a novel approach for detection of DNA-protein interactions. This approach is based on dual labeling of DNA probes using two different electroactive labels, which yield reduction peaks at distinct potentials and therefore enable detection of protein binding in a competition experiment. We show that using this approach, specific and non-specific binding of the p53 protein can be distinguished as a strong preference of the p53 protein was observed towards DNA probes bearing a specific p53 binding site (p53CON). Label-free detection using intrinsic DNA signals was used in studies of terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) tailing reactions. We found out that electrochemical detection can be very useful for monitoring the TdT tailing reactions, especially with pyrolytic graphite electrode (PGE) being suitable for remarkably precise determination of the tailing reaction products length. On the other hand, hanging mercury drop electrode (HMDE) revealed formation of various DNA structures, such as DNA hairpins and G-quadruplexes, which influence behavior of DNA molecules at the negatively charged surface of HMDE as well as progress of the TdT tailing reaction. Modification with osmium tetroxide complex was applied in development of a new two-step technique of DNA modification, which comprised enzymatic construction of DNA bearing butyl acrylate (BA) moieties followed by chemical modification of a reactive C=C double bond in the acrylate residue. Such approach enabled modification of the BA conjugates in both single- and double-stranded (ds) DNA under conditions precluding modification of nucleobase residues in ds DNA.

Keywords

electrochemistry, DNA-protein interactions, p53 protein, DNA labeling, terminal deoxynucleotidyl transferase, elektrochemie, DNA-protein interakce, protein p53, značení DNA, terminální deoxynukleotidyl transferáza

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 27. 8. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 12. 10. 2018
• Vedoucí: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.
• Oponent: prof. RNDr. Libuše Trnková, CSc., doc. RNDr. Petr Pečinka, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Molekulární a buněčná biologie