Molekulární analýza přestaveb imunoglobulinových genů a jejich význam u B-buněčných lymfoproliferací

Mgr. Kamila Stránská, Ph.D.

Doctoral thesis

Molecular analysis of immunoglobulin gene rearrangements and their significance in B-cell lymphoproliferations

Abstract:

Až u 25 % případů chronické lymfocytární leukémie (CLL) mohou být zachyceny vícečetné klonální produktivní přestavby genů pro těžký řetězec imunoglobulinu (MP-IGH), které poukazují na možnou oligoklonalitu. Většina případů s MP-IGH je ale homogenní v klíčových imunofenotypových znacích svědčících o monoklonální expanzi. Cílem této práce bylo objasnit klonalitu těchto případů. Pro nedostatek epidemiologických studií CLL zohledňujících klonalitu a imunogenetické vlastnosti onemocnění bylo dalším cílem identifikovat u podskupin CLL roztříděných podle těchto kritérií specifické populační, sociální a zdravotní charakteristiky. U všech CLL pacientů byly analyzovány přestavby IGH lokusu s využitím standardizovaných PCR metodik. Klonalita byla u CLL pacientů s MP-IGH vyšetřena na úrovni RNA jednotlivých buněk s využitím sortování jednotlivých buněk a vícekrokové vnořené RT-PCR. Analýza jednotlivých buněk byla doplněna sekvenováním nové generace. Národní studie možných epidemiologických asociací u CLL pacientů byla vedena přes dotazníky vyšetřující zdravotní a sociální anamnézu pacientů. V kohortě 1534 CLL pacientů bylo identifikováno 75 případů CLL s MP-IGH (4,9 %). Dvacet dva případů s počtem klonálních P-IGH převyšujícím počet imunofenotypově rozlišených CLL populací bylo analyzováno na úrovni RNA jednotlivých buněk. Analýza potvrdila ve všech testovaných případech příslušnost každé P-IGH jinému buněčnému klonu; alelická inkluze IGH nebyla zachycena. Ve všech 75 případech byla vyloučena možnost, že jedna P-IGH vznikla z druhé společně zachycené nahrazením genu IGHV. Výskyt IGH přestaveb se shodným mutačním statusem IGHV byl mezi případy CLL s MP-IGH pozoruhodně vysoký, což naznačuje společné faktory ovlivňující vývoj klonů. Srovnání klinických a biologických vlastností ukázalo, že se případy s MP-IGH a jedinou P-IGH liší pouze ve věku při diagnóze. Epidemiologické dotazníky byly získány od 573 CLL pacientů v šesti hematologických centrech. Pacienti s oligoklonální CLL častěji uváděli hypercholesterolémii, hypertenzi a herpes simplex a u příbuzných prvního stupně nádory (a samostatně také CLL) častěji než pacienti s monoklonálním onemocněním. Mezi pacienty se stereotypními B-buněčnými receptory (BCR) byla zjištěna častější konzumace alkoholu a chronické infekce trávicího traktu u subsetu #1 a cholecystektomie a familiární CLL u subsetu #2. Tato práce dokazuje, že každá zachycená P-IGH patří u CLL pacientů s MP-IGH nezávislému klonu B lymfocytů i v případech imunofenotypově monoklonálního onemocnění. Bylo identifikováno několik možných souvislostí mezi určitými zdravotními a sociálními anamnestickými záznamy a klonalitou CLL a vlastnostmi BCR, zejména stereotypií.

Abstract:

In up to 25% of chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients, multiple clonal productive immunoglobulin heavy chain gene rearrangements (MP-IGHs) can be detected, suggesting oligoclonality. However, most MP-IGH cases are homogeneous in key immunophenotype features, indicating monoclonal expansion. This work aimed to determine the clonality of such cases. As there is a scarcity of CLL epidemiologic studies which take into consideration disease clonality and immunogenetic features, the next aim was to identify the specific population, social, and health characteristics in CLL subgroups based on disease clonality and immunogenetic criteria. In all CLL patients, IGH gene rearrangements were analyzed using standardized PCR methodology. Clonality in MP-IGH patients was investigated at the single-cell RNA level using single-cell sorting and multistep nested RT-PCR. Single-cell analysis was supplemented with next-generation sequencing. A nation-wide survey of potential epidemiological associations in CLL patients was conducted using questionnaires inquiring about specific health and social conditions. In a cohort of 1534 CLL patients, 75 CLL cases with MP-IGHs (4.9%) were collected. Twenty-two cases with the number of clonal P-IGHs exceeding the number of immunophenotypically distinct CLL populations were analyzed at the single-cell RNA level. The analysis confirmed that each detected P-IGH belonged to a separate cell clone in all tested cases; IGH allelic inclusion was not observed. The possibility of IGHV replacement as a link between coexisting P-IGHs was excluded in all 75 cases. The occurrence of IGH rearrangements with concordant IGHV mutational status in MP-IGH CLL cases was remarkably high, suggesting common factors affecting the development of the coexisting clones. A comparison of clinical and biological characteristics revealed age at diagnosis to be the only difference between MP-IGH and single P-IGH CLL cases. Epidemiological questionnaires were collected in a cohort of 573 CLL patients at six hematological centers. Patients with oligoclonal CLL reported hypercholesterolemia, hypertension, herpes simplex, and tumors (and separately also CLL) in first-degree relatives more often than patients with the monoclonal disease. In patients with stereotyped B-cell receptors (BCRs), more frequent alcohol consumption and chronic infections of the digestive system were found in subset #1 and cholecystectomies and familial CLL in subset #2. This study demonstrates that each P-IGH detected in a MP-IGH CLL patient belongs to an independent B-cell clone even in the immunophenotypically monoclonal disease. Several potential links were found between certain health and social conditions and CLL clonality and BCR features, especially stereotypy.

Keywords

chronická lymfocytární leukémie, B-buněčný receptor, klonalita, analýza jednotlivých buněk, dotazník, anamnéza, asociační studie, chronic lymphocytic leukemia, B-cell receptor, clonality, single-cell analysis, questionnaire, patient history, association study

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 1. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 18. 2. 2022
• Supervisor: Mgr. Karla Plevová, Ph.D.
• Reader: doc. MUDr. Eva Froňková, Ph.D., Assist. Prof. Andreas E. Agathangelidis, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology and Hematology / Experimental Oncology and Tumor Biology