Analýza prognostických markerů u leukemií pomocí nových molekulárně-biologických přístupů

PharmDr. Jana Kmínková, Ph.D.

Doctoral thesis

Analysis of prognostic markers in leukemias using new molecular-biological approaches

Abstract:

Úvod: Exprese krátkých nekódujících regulačních RNA - mikroRNA (miRNA) - je změněna u řady nádorových onemocnění včetně chronické lymfocytární leukémie (CLL). Přestože přesný mechanismus zodpovědný za tuto aberantní expresi není znám, jednou z předpokládaných příčin je přítomnost jednonukleotidových polymorfismů (SNP) a mutací v genech pro miRNA, které mohou mimo jiné ovlivnit i sekundární strukturu dané miRNA. Jejich frekvence ani význam však zatím nebyly detailně popsány u pacientů s chronickou lymfocytární leukémií. Metody: Metodou resekvenačních mikročipů jsme analyzovali přítomnost sekvenčních variant u 109 nádorově-asociovaných miRNA v souboru 98 vysoce rizikových CLL pacientů. Dále byla v souboru 213 CLL pacientů metodou Sangerova sekvenování zjišťována přítomnost sekvenčních záměn v primární oblasti dvou miRNA (miRNA-29b-2/29c), jejichž aberantní exprese je asociována s patogenezí CLL. Sekvenací DNA izolované ze stěru z bukální sliznice byl u nalezených záměn zjišťován jejich zárodečný/somatický původ. S použitím programu RNAfold byl analyzován vliv záměn na sekundární strukturu dané miRNA. U nalezených SNP byly studovány rozdíly v jejich alelické frekvenci ve studovaném souboru CLL pacientů a kontrolní populací. Vliv nové záměny detekované v pre-miR-16-1 na její expresi byl studován metodou kvantitativní real-time PCR po naklonování daného konstruktu do expresního vektoru a jeho transfekci do buněk HEK-293. S použitím real-time PCR byl také studován vliv záměn nalezených v miRNA-29. Výsledky: Celkem jsme detekovali 6 nových záměn a 27 SNP. Nová záměna byla nalezena v miRNA-16-1, která je hraje důležitou úlohu v patogenezi CLL. Většina z nalezených záměn měla vliv na sekundární strukturu dané miRNA, u několika SNP byly pozorovány významné rozdíly v jejich alelické frekvenci mezi CLL pacienty a kontrolní populací. Při podrobnější analýze miR-29b jsme zjistili, že její exprese je ovlivněna přítomností polymorfní inserce, která se častěji vyskytovala u CLL populace než u kontrolní skupiny. Dále jsme prokázali vliv záměny detekované v pre-miR-16-1 na expresi maturované miR-16-1. Závěr: Z této práce tedy vyplývá, že sekvenční varianty v genech pro mikroRNA se vyskytují u CLL pacientů a mohou být asociovány s patogenezí této choroby.

Abstract:

Background: The expression of microRNAs (miRNAs), which are short non-coding RNA regulating gene expression, is deregulated in many tumors including chronic lymphocytic leukemia (CLL). Although the particular mechanism responsible for their aberrant expression is not well characterized, the presence of mutations and single nucleotide polymorphisms (SNP) in miRNA genes, possibly affecting their secondary structure and expression, has been described. In CLL, however, the impact and frequency of such variations have yet to be elucidated. Methods: Using a custom resequencing microarray, we screened sequence variations in 109 cancer related miRNAs in 98 high-risk CLL patients. Additionally, primary regions of two CLL-related miRNAs (miR 29b 2/29c) were analyzed by Sanger sequencing in another cohort of 213 CLL patients. By sequencing of DNA isolated from buccal swabs we analyzed whether the detected variations are of somatic/germline origin. The effect of sequence variations on miRNA secondary structure was studied using RNAfold tool. Concerning SNPs, their allelic frequency was compared between CLL patients and a control population. The effect of the novel pre-miR-16-1 variation was studied by real-time PCR after the particular construct harboring the novel vbariation had been cloned into an expression vector and transfected into HEK-293 cells. The effect of sequence variations detected in miRNA-29 on its expression was also analyzed by real-time PCR. Results: Altogether, we detected 6 novel miR-sequence variations and 27 SNPs. One novel variation was also found in miR-16-1 which is known to be related to CLL pathogenesis. Most of the variations changed miR-secondary structure, and the allelic frequency of some of the identified SNPs differed significantly between CLL patients and a control population. More detailed analysis of miR-29b-2 showed that its expression is influenced by presence of a polymorphic insertion which is more frequent in CLL than in a control population. We also show that the novel pre-miR-16-1 variation affects the expression of mature miR-16-1. Conclusions: Altogether, these data suggest that sequence variations may be related to CLL pathogenesis.

Keywords

mikroRNA, jednonukleotidový polymorfismus, chronická lymfocytární leukémie, resekvenační mikročip, Sangerovo sekvenování, real-time PCR, transfekce, microRNA, single nucleotide polymorphism, chronic lymphocytic leukemia, resequencing microarray, Sanger sequencing, transfection

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 11. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 22. 11. 2013
• Supervisor: prof. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology (4-years) / Oncology