Mechanismy (de)regulace BCR-signalizace u maligních B-lymfocytů

Mgr. Václav Šeda, Ph.D.

Doctoral thesis

The mechanisms of BCR signaling (de)regulation in malignant B cells

Abstract:

Úvod: Recirkulace buněk chronické lymfocytární leukemie (CLL) mezi periferní krví a mikroprostředím imunitních buněk hraje důležitou roli v biologii CLL. Do současnosti však nebylo detailně popsáno, jak přesně CLL buňky regulují tyto migrační procesy, jak kontrolují přežití v periferní krvi, případně své rozhodnutí vrátit se zpět do mikroprostředí lymfatických orgánů. Metody: Provedli jsme RNA sekvenaci CXCR4dimCD5bright a CXCR4brightCD5dim populací, čímž byly identifikovány desítky rozdílně exprimovaných genů hrajících roli v migraci. Následující in vivo a in vitro experimenty nám umožnily popsat významnou roli GAB1 (GRB2 associated binding protein 1) proteinu v procesu migrace a regulace takzvané tonické signalizace. Také jsme testovali možnost využití GAB1 inhibitorů cílících na jeho PH doménu. Výsledky: Již dříve byly CXCR4/CD5 subpopulace navrženy jako model umožňující rozlišit mezi buňkami připravenými migrovat do lymfatických orgánů (CXCR4brightCD5dim) a buňkami, které nedávno vycestovaly z tohoto prostředí do periferní krve (CXCR4dimCD5bright). Intravenózní aplikace těchto dvou subpopulací do NOD scid gamma (NSG) myši potvrdila zvýšený migrační potenciál CXCR4brightCD5dim buněk do myší sleziny. Následná sekvenace CXCR4/CD5 subpopulací identifikovala 147 rozdílně exprimovaných genů zapojených do procesu migrace. Jedním z nich byl i GAB1, který byl v CXCR4brightCD5dim buňkách přítomen v přibližně dvojnásobném množství. Vyřazení GAB1 v MEC1 buňkách, případně jeho utišení pomocí siRNA v primárních CLL buňkách, vedlo k potlačení migračního potenciálu vůči chemoatraktantům jako SDF1, CXCL13 případně kondiciovanému médiu produkovanému stromálními buňkami kostní dřeně (CMhMSC). Podobná data jsme získali i v in vivo experimentu, kde vyřazení GAB1 významně redukovalo migraci buněk do myší sleziny. Ovlivnění buněk pomocí SDF1, CXCL13 případně CMhMSC vedlo k rychlé aktivaci GAB1, což naznačuje jeho zapojení do rozdílných chemotaktických signálních drah. Také jsme popsali roli GAB1 v udržování takzvané tonické signalizace, která se projevuje nízkou hladinou aktivního AKT. V dalším kroku jsme popsali mechanizmus zvýšení produkce GAB1, který je závislý na aktivaci transkripčního faktoru FoxO1. Zvýšené množství FoxO1/GAB1 proteinů tak v CXCR4brightCD5dim buňkách přispívá k lepšímu přežívání CLL buněk v periferní krvi a významně ovlivňuje jejich následnou migraci do mikroprostředí imunitních orgánů. Podání ibrutinibu pacientům s CLL indukuje FoxO1/GAB1, což následně vede k obnově aktivity AKT během několik dnů až týdnů. Ukázali jsme, že tento proces můžeme blokovat GAB1 inhibitory. Závěr: Popsali jsme nové mechanizmy regulace migrace a tonické AKT signalizace, které jsou založené na modulaci FoxO1/GAB1 proteinů. Role těchto proteinů byla dále zkoumána v kontextu terapie ibrutinibem, která indukuje FoxO1/GAB1 dráhu a využívá k opětovné aktivaci AKT. Demonstrovali jsme také, že tyto mechanizmy mohou být inhibovány pomocí nových GAB1 inhibitorů.

Abstract:

Background: Chronic lymphocytic leukemia (CLL) cell recirculation to and from immune niches plays an important role in CLL biology. However, it remains largely unknown how precisely CLL cells regulate their homing or how they balance survival in peripheral blood and the decision to return to immune niches. Methods: We performed RNA profiling of CXCR4dimCD5bright versus CXCR4brightCD5dim cells and identified differential expression of dozens of molecules with a putative function in CLL cell migration. By series of in vivo and in vitro experiments we described the role of GRB2 associated binding protein 1 (GAB1) in the migration process and its positive role in the regulation of tonic signaling. We also tested novel GAB1 inhibitors targeting its PH domain. Results: CXCR4/CD5 subpopulations have been suggested as a model distinguishing CLL cells ready to re-enter immune niches (CXCR4brightCD5dim) versus recent emigrants from lymph nodes (CXCR4dimCD5bright). Indeed, intravenous injection of sorted CXCR4/CD5 subpopulations into NOD scid gamma (NSG) mice revealed increased migration capacity of CXCR4brightCD5dim cells into the spleen. Subsequent RNAseq of sorted CXCR4/CD5 subpopulations identified 147 migration-related differentially expressed genes, among which we noted upregulation of GAB1 (~2-fold) in CXCR4brightCD5dim cells. GAB1-knockout in MEC1 cells or silencing by siRNA in primary CLL cells largely inhibited their migration capacity towards chemokines SDF1, CXCL13, or conditioned media produced by bone marrow stromal cells (CMhMSC). Importantly, GAB1 knockout or silencing led to impaired migration of malignant B cells to the spleen of NSG mice. Treating cells with SDF1, CXCL13, or CMhMSC led to rapid GAB1 phosphorylation, suggesting that GAB1 is involved in response to various soluble cytokines. We have also identified another GAB1 function in the maintenance of “tonic” AKT phosphorylation via PI3K. Next, we demonstrated that transcription factor FoxO1 transcriptionally activates GAB1 by direct binding to its promotor. Altogether, increased FoxO1/GAB1 levels in CXCR4brightCD5dim CLL cells are contributing to balancing CLL cells’ survival and their decision to migrate into the immune niches. Notably, administration of ibrutinib in CLL patients induces FoxO1-GAB1, which leads to recovery of phospho-AKT within several days or weeks on ibrutinib and this can be targeted by novel GAB1 inhibitors. Conclusion: Here, we described a novel FoxO1/GAB1-dependent regulatory mechanism of CLL homing and maintenance mechanism for “tonic” AKT signaling activity in an intraclonal CXCR4brightCD5dim CLL subpopulation. We showed for the first time that ibrutinib treatment leads to the accumulation of FoxO1/GAB1 proteins which subsequently leads to AKT phosphorylation and activation. We demonstrated that GAB1 inhibitors can be used to inhibit CLL cell migration, basal AKT activity, and adaptive AKT activation during the ibrutinib therapy.

Keywords

Chronická lymfocytární leukemie, GAB1, FoxO1, AKT, protein kináza B, adaptace, BCR inhibitor, ibrutinib

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 6. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 24. 9. 2021
• Supervisor: doc. MUDr. Mgr. Marek Mráz, Ph.D.
• Reader: MUDr. Martin Šimkovič, Ph.D., doc. MUDr. Daniel Lysák, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology and Hematology / Experimental Oncology and Tumor Biology