Vývoj strategií pro cílenou eliminaci buněk CLL s mutacemi v genu TP53

Mgr. Miroslav Boudný, Ph.D.

Doctoral thesis

Development of strategies for targeted elimination of CLL cells with mutations in the TP53 gene

Abstract:

Úvod: Navzdory rozšířeným terapeutickým možnostem zůstává chronická lymfocytární leukémie (CLL) nevyléčitelným onemocněním, u něhož pacienti s defekty v genu TP53 vykazují obzvláště nepříznivou prognózu. Cílem studie bylo otestovat potenciál inhibice proteinu CHK1 (Checkpoint kinase 1) u CLL pomocí inovativního inhibitoru MU380, který je netriviálním analogem klinicky testovaného inhibitoru SCH900776 (Merck). Kináza CHK1 plní důležitou úlohu v odpovědi na poškození DNA a podílí se na regulaci buněčného cyklu. Jedná se o atraktivní cíl protinádorové terapie testovaný u řady nádorových onemocnění v preklinických i klinických studiích. Metody: Stimulace buněk CLL byla provedena kokultivací s myšími fibroblasty, protilátkou anti-CD40 a IL-4. Viabilitu buněk jsme měřili pomocí testu WST-1. Hladina vybraných proteinů se detekovala western blotem. Apoptóza a buněčný cyklus byly analyzovány pomocí průtokové cytometrie a barvení DiOC6/PI. Aktivaci dráhy p53 jsme sledovali pomocí real time PCR. Transfekce buněk CLL byly provedeny elektroporací pomocí přístroje Neon. Pro experimenty in vivo byl využit myší kmen NOD-scid IL2Rγnull s lokalizovanými nádory vytvořenými subkutánní aplikací buněk MEC-1. Imunohistochemická analýza se prováděla pomocí parafinových řezů barvených hematoxylinem a příslušnou protilátkou. Výsledky: Inhibitor MU380 efektivně zablokoval aktivitu kinázy CHK1, a tím pádem i celou signální dráhu ATR-CHK1. MU380 snižoval viabilitu všech testovaných buněčných linií leukémií a lymfomů. Aplikace inhibitoru vedla k zastavení buněčného cyklu, poškození DNA a masivní apoptóze. Naopak nenádorové buňky byly k inhibitoru výrazně rezistentnější. U nedělících se buněk CLL z periferní krve se nám podařilo detekovat hladinu proteinu CHK1. CHK1 byla po poškození DNA dokonce schopná aktivace, což dokládá funkčnost dráhy ATR-CHK1 u těchto buněk. Aplikace inhibitoru MU380 vedla k poklesu viability jak u buněk CLL stimulovaných k proliferaci, tak i u nestimulovaných buněk CLL, a to bez ohledu na negativních prognostické faktory (defekty v genech TP53 a ATM). Na molekulární úrovni MU380 zvyšoval replikační stres a/ nebo poškození DNA a vedl k indukci apoptózy. Aktivita MU380 byla nezávislá na aktivaci dráhy p53. Fenotyp inhibice CHK1 se u buněk CLL potvrdil transfekcí siRNA cílené proti CHEK1, kdy také docházelo k poklesu viability. Výrazný efekt inhibice CHK1 jsme pozorovali rovněž ve dvou nezávislých experimentech in vivo. Sedm aplikací MU380 inhibovalo růst nádorů o 44 %, deset aplikací inhibitoru pak o 61 %. Závěr: Inhibice proteinu CHK1 představuje potenciální inovativní možnost terapie TP53-mutované CLL.

Abstract:

Background: Despite expanded therapeutic options, chronic lymphocytic leukemia (CLL) remains an incurable disease in which patients with TP53 defects show particularly adverse prognosis. The aim of the study was to analyze the potential of checkpoint kinase 1 (CHK1) protein inhibition in CLL using an innovative inhibitor MU380, a nontrivial analogue of the clinically tested inhibitor SCH900776 (Merck). CHK1 is a kinase that plays an important role in the DNA damage response and is involved in cell cycle regulation. It is an attractive target for anticancer therapy, which is tested in a number of cancers in both preclinical and clinical studies. Methods: CLL cells were stimulated by co-culture with mouse fibroblasts, anti-CD40 antibody and IL-4. Cell viability was measured using WST-1 assay. The level of selected proteins was detected by western blot. Apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry and DiOC6/PI staining. Activation of p53 pathway was monitored using real time PCR. Transfections of CLL cells were performed by electroporation using Neon Transfection System. For in vivo experiments, NOD-scid IL2Rγnull mice strain with localized tumors generated by subcutaneous administration of MEC-1 cells was used. Immunohistochemical analysis was performed using paraffin sections stained with hematoxylin and the respective antibody. Results: MU380 inhibitor effectively blocked the CHK1 kinase activity and thus the entire ATR-CHK1 pathway. MU380 reduced the viability of all tested leukemia and lymphoma cell lines. Application of the inhibitor led to cell cycle arrest, DNA damage and massive apoptosis. In contrast, non-cancerous cells were significantly more resistant to the inhibitor. Interestingly, we detected the CHK1 protein level in non-dividing peripheral blood CLL cells. CHK1 was even capable of activation upon DNA damage, demonstrating the functionality of the ATR-CHK1 pathway in these cells. MU380 administration resulted in a viability decrease in both CLL cells stimulated to proliferate and unstimulated CLL cells, regardless of negative prognostic factors (defects in TP53 and ATM genes). At the molecular level, MU380 increased replication stress and/or DNA damage and led to apoptosis induction. MU380 activity was independent of p53 pathway activation. The phenotype of CHK1 inhibition was confirmed using siRNA transfection targeted against CHEK1, which also decreased cell viability. A significant effect of CHK1 inhibition was also observed in two independent in vivo experiments. Seven applications of MU380 inhibited tumor growth by 44 %, ten applications by 61 %. Conclusions: CHK1 inhibition represents a potential innovative therapeutic option for TP53-mutated CLL.

Keywords

chronická lymfocytární leukémie, CLL, checkpoint kinase 1, CHK1, ATR, p53, TP53, inhibice, cílená léčba, chronic lymphocytic leukemia, inhibition, targeted therapy

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 11. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 13. 12. 2019
• Supervisor: doc. Mgr. Martin Trbušek, Dr.
• Reader: doc. MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D., Mgr. Michal Šmída, Dr. rer. nat., prof. MUDr. Jan Trka, Ph.D

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology and Hematology / Experimental Oncology and Tumor Biology