Zebrafish embryo assay and its application in the research of chemical mixtures

Ing. Adam Jonáš, M.Sc.

Doctoral thesis

Anotácia:

Embryonální test s Danio rerio poskytuje všestranné využití ve výzkumu a je považován za náhradu testování na zvířatech dle platné legislativy EU a principu 3R. Zvláště v toxikologii umožňuje test s embryi Danio rerio nahradit mnoho tradičních testů s dospělci ryb při výzkumu směsí, environmentálních vzorků, estrogenity, neurotoxicity, teratogenity nebo mortality. Chemické směsi zůstávají významnou výzkumnou otázkou vzhledem k jejich komplexitě a limitované předpověditelnosti. Je náročné posoudit jejich kombinované efekty jako například endokrinní disrupci či neurotoxicitu. Cílem této dizertace bylo posoudit použitelnost testů s embryi Danio rerio pro výzkum chemických směsí, které zahrnovaly vzorky z cyanobakterií (Study I a II), směsí prioritních látek z rámcové směrnice o vodách (Study III) a odtoků z čistíren odpadních vod (Study IV). Jako nástavba ke standardním letálním a subletálním efektům sledovaným u Danio rerio byla v této dizertaci hodnocena estrogenita a neurotoxicita in vivo doplněná in vitro reportérovými esejemi (estrogenní a retinoidní aktivita). Kombinace in vitro a in vivo esejí byla zvláště prospěšná při studiu komplexních vzorků z cyanobakterií (Study I a II). Retinoidní aktivita vzorků z cyanobakterií v jejich environmentálně relevantních koncentracích byla pozorována in vitro i in vivo jako teratogenita u Danio rerio. Tyto nově studované retinoidy mohou vysvětlit dříve pozorovanou toxicitu u embryí ryb. Rovněž byly pozorovány neurotoxické efekty metabolitů cyanobakterií a prodloužení embryí. Estrogenní aktivita in vitro se překvapivě nepotvrdila u estrogenní aktivity in vivo, nejspíše následkem interakcí látek ve směsi. Tradičně studované toxiny (jako mikrocystin) byly shledány jako méně důležité vzhledem k embryotoxicitě cyanobakterií. Dále byly zkoumány směsi složené z prioritních nebezpečných látek definovaných evropskou Rámcovou směrnicí o vodách v jejich bezpečných individuálních koncentracích (Study III). V těchto směsích byla pozorována v několika bioesejích (i u embryí Danio rerio) řada subletálních efektů, což naznačuje, že v současnosti aplikovaný chemický monitoring jednotlivých látek nemusí dostatečně chránit vodní organismy. Je proto velmi důležité začlenit bioeseje (monitorování na základě efektů) pro kvantifikování celkové nebezpečnosti (toxicity) chemických směsí. Hodnocení odtoků z čistíren odpadních vod z EU v této dizertaci (Study IV) odhalilo vysokou toxicitu některých vzorků, což znovu ukazuje na potřebu hodnocení toxicity celých směsí za pomoci bioesejí. Vzorky, které byly hodnoceny jako estrogenní in vitro, nebyly potvrzeny jako estrogenní in vivo za pomoci Danio rerio s největší pravděpodobností z důvodu různé senzitivity a kvůli matričním efektům ve směsích v odtocích, což opět ukazuje na důležitost kombinace in vivo a in vitro metodik. Prezentovaná disertační práce demonstruje, že embryonální esej s Danio rerio je všestranným modelem pro hodnocení chemických směsí jako komplexních toxických vzorků nebo modelových chemických směsí. Zvláště pak v kombinaci s in vitro reportérovými genovými esejemi poskytuje náhled do toxických mechanismů a přináší důležitou přidanou hodnotu do komplexního environmentálního monitorování.

Abstract:

The zebrafish embryo assay provides countless opportunities in research. It is considered an animal test replacement with respect to EU law and principals of 3Rs (replacement, reduction and refinement). Especially in toxicology, zebrafish embryo assays serve as a replacement of many traditional tests with adult fish for studies of teratogenicity, estrogenicity, neurotoxicity, mortality or in the assessment of mixtures and environmental samples. Chemical mixtures remain a major research question due to their complexity and limited predictability and their combined effects such as endocrine disruption or neurotoxicity are scientifically challenging. The objective of this dissertation was to investigate applicability of the zebrafish embryo assays for research of chemical mixtures, which included cyanobacterial samples (Study I and II), mixture of priority pollutants of Water Framework Directive (Study III), and waste water treatment plants effluents (Study IV). Estrogenicity and neurotoxicity were assessed within this dissertation in extension to standard lethal and sublethal endpoints evaluated in zebrafish complemented by in vitro reporter gene assays (estrogenicity and retinoid-like activity). Combined approach of in vitro and in vivo assays provided special added value in the studies of complex cyanobacterial samples (Study I, II). Retinoid-like activity of cyanobacterial samples was observed in environmentally relevant concentrations both in vitro as well as in vivo – i.e. teratogenicity in zebrafish embryo assay. Newly studied retinoids might explain previously observed toxicity in fish embryos. Effects of cyanobacterial metabolites on length and neurotoxicity were also noted. Interestingly, estrogenic potential observed in vitro was not confirmed during the in vivo embryonal assays most likely due to the interactions of diverse chemicals within the mixture. Traditionally studied toxins (as microcystins) were found to play minor role in the embryotoxicity of cyanobacteria. Mixtures of priority pollutants as defined by EU Water Framework Directive were studied at the safe concentrations of individual components (Study III). Several sublethal effects were observed in number of bioassays (including zebrafish embryos) indicating that currently used chemical monitoring of individual compounds may not sufficiently ensure safety of mixtures towards aquatic biota. It is therefore highly important to implement bioassays (effect-based monitoring) to quantify the overall hazards (toxicity) of chemical mixtures. The assessment of European waste water treatment plants effluents within this dissertation (Study IV) revealed high toxicity of some samples again indicating the need for the whole mixture toxicity assessment by bioassays. Interestingly, samples found to be estrogenic in vitro were not confirmed to be estrogenic in the in vivo zebrafish assay most likely due to different sensitivity and matrix effects within the effluent mixture pointing to the importance of combined use of both in vivo and in vitro methods. The presented dissertation demonstrates that zebrafish embryo assay is a versatile model for the evaluation of chemical mixtures such as complex toxic samples or model chemical mixtures. Especially in combination with mechanistic in vitro reporter gene assays it provides insights into the toxic mechanisms and brings important added value into complex environmental monitoring.

Keywords

Zebrafish, retinoids, cyanobacteria, developmental toxicity, fish embryo test, mixtures, danio pruhované, retinoidy, cyanobakterie, vývojová toxicita, rybí embryonální test, směsi

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 17. 5. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 20. 6. 2016
• Vedúci: prof. RNDr. Luděk Bláha, Ph.D.
• Oponent: doc. Ing. Radovan Kopp, Ph.D., prof. Ing. Blahoslav Maršálek, CSc., dr. hab. Ing. Josef Velíšek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology (4-years) / Ekotoxicology