The role of hypoxia inducible factors in cardiomyogenesis in vitro

Mgr. Jana Kudová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Vývoj a dozrávání srdečních progenitorových buněk, kardiomyogeneze, je přísně regulovaný proces řízený interakcemi mezi specifickými signálními dráhami, transkripční faktory a buněčným mikroprostředím. Je známo, že vývoj srdce a jeho funkčnost je významně závislá na faktorech indukovaných hypoxií (HIF). Nicméně úloha HIF-1alpha při formování a dozrávání srdečních progenitorových buněk zůstává doposud neznámá. K objasnění této role byl použit in vitro model spontánně diferencujícovaných kontrolních a HIF-1alpha deficientních myších embryonálních kmenových buněk (mESC). Výsledky prezentované v rámci této dizertační práce ukazují, že deficience HIF-1alpha významně snižuje kvalitu i kvantitu vznikajících kardiomyocytů odvozených z mESC. To bylo prokázáno na úrovni mRNA i na úrovni proteinů, pomocí detekce snížené hladiny markerů specifických pro kardiomyocyty (těžký řetězec myozinu 6 a 7) a také pomocí nižšího procentuálního zastoupení buněk pozitivních na těžký řetězec myozinu alpha/beta. S ohledem na strukturní a fyziologické aspekty kardiomyocytů odvozených od mESC, byl detekován rozdíl v lokalizaci kontraktilních proteinů (srdeční troponin T, těžký řetězec myosinu alpha/beta), změny v organizaci myofibril, stejně tak jako ovlivnění délky trvání kontrakce. Navíc, změny pozorované v in vitro diferenciaci HIF-1alpha deficientních buněk, jsou spojeny s významně nižší expresí endodermálního markeru (hepatocytární nukleární faktor 4 alpha). Nedávné studie naznačily, že stabilizace HIF-1alpha může být přímo regulovaná melatoninem, přírodně se vyskytujícím hormonem, který navíc díky jeho antioxidačním vlastnostem přispívá k ochraně srdce proti jeho poškození. Naše data ukazují, že melatonin, prostřednictvím inhibice stabilizace a transkripční aktivity HIF-1alpha, významně zvyšuje expresi markerů specifických pro kardiomyocyty (těžký řetězec myosinu 6 a 7), stejně jako procentuální zastoupení buněk pozitivních na těžký řetězec myosinu alpha/beta. Dále jsme ukázali, že delece HIF-1alpha inhibuje jak celkový efekt melatoninu podporující kardiomyogenní fenotyp, tak i melatoninem zprostředkovanou regulaci HIF-2alpha. Na základě těchto dat je patrné, že HIF-1alpha hraje odlišnou roli během různých fází vývoje a dozrávání srdečních buněk. Ačkoliv HIF-1alpha deficience snižuje spontánní kardiomyogenezi prostřednictvím negativní regulace diferenciace kardiomyocytů a inhibice endodermálního vývoje, časově závislá, melatoninem zprostředkovaná inhibice HIF-1alpha celkovou kardiomyogenezi podporuje. Výsledky prezentované v této práci napomáhají k objasnění mechanismů souvisejících s dozráváním srdečních progenitorových buněk, a tak přispívají k identifikaci potenciálních terapeutických cílů.

Abstract:

The process of the differentiation and maturation of cardiac progenitor cells, also termed cardiomyogenesis, is controlled by precise interactions between specific signaling pathways, transcription factors, and the cellular microenvironment. It is known that the heart development and functions are critically dependent on hypoxia-inducible factors (HIF). However, the role of HIF-alpha in the formation and maturation of cardiac progenitor cells remains unknown. To clarify this, the in vitro model of spontaneously differentiated mouse embryonic stem cells (mESC) with wild type and knocked out HIF-1alpha gene expression was employed. Data presented in this thesis show that HIF-1alpha deficiency significantly altered both the quality and quantity of mESC-derived cardiomyocytes. It was accompanied with lower mRNA and protein levels of cardiac cell specific markers (myosin heavy chains 6 and 7) and with a decreasing percentage of myosin heavy chain alpha/beta positive cells. As to structural and the physiological aspects of differentiated cardiac-like cells, the localization of contractile proteins (cardiac troponin T, myosin heavy chain alpha/beta), the organization of myofibrils as well as duration of contraction were affected. Interestingly, an observed alteration in the in vitro differentiation scheme of HIF-1alpha deficient cells was accompanied with significantly lower expression of endodermal marker (hepatic nuclear factor 4 alpha). Recently, several studies have shown that HIF-alpha stabilization is regulated via melatonin, a naturally-occurring hormone, contributing to the protection of heart against myocardial injuries especially via its antioxidant capacity. Here we report that melatonin significantly upregulates the expression of cardiac cell specific markers (myosin heavy chains 6 and 7) and the percentage of myosin heavy chain positive cells via the inhibition of HIF-1alpha stabilization and transcriptional activity. We further observed that the deletion of HIF-1alpha completely inhibits the pro-cardiomyogenic effect of melatonin as well as melatonin-mediated HIF-2alpha stabilization. Thus, based on our data we suggest that HIF-1alpha have different roles during various stages of cardiac cell differentiation. Although the HIF-1alpha deficiency attenuates spontaneous cardiomyogenesis via negative regulation of both cardiomyocytes differentiation/ maturation and endoderm development, time-specific HIF-1alpha inhibition, via melatonin, can support overall cardiomyogenesis in vitro. The results presented here contribute to the clarification of the mechanisms underlying the maturation of cardiac progenitor cells and thus indicate possible therapeutic targets.

Keywords

kardiomyogeneze, embryonální kmenové buňky, HIF, melatonin, cardiomyogenesis, embryonic stem cells

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 20. 6. 2016
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.
• Reader: doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc., Dr. Anke Zieseniss

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology