The role of hypoxia in the regulation of heart regeneration capacity

Mgr. Lucia Binó, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Regenerační potenciál dospělého savčího srdce je tradičně vnímán jako velice omezený a kardiovaskulární onemocnění tak představují celosvětově nejčastější příčinu úmrtí. Předkládaná dizertační práce si klade za cíl prohloubit znalosti a poodhalit mechanismy, které by umožňovaly plně rozvinout regenerační kapacity srdce. Konkrétně je tato práce zaměřena na možnou roli hypoxie (snížené hladiny kyslíku) v regulaci těchto mechanismů. V rámci mnoha patofyziologických stavů si savčí srdce uchovává schopnost návratu ke genové expresi podobné té ve fetálním vývoji. Tento jev je spojen mimo jiné se změnami v expresi těžkých řetězců myosinu (myosin heavy chains, MHC), proteinů zodpovědných za kontrakci srdce. V této práci předkládáme hypotézu, že klíčovou roli v regulaci exprese MHC hraje hypoxie, jev společný jak pro časný vývoj srdce, tak pro srdečné selhání. Dále předpokládáme, že návrat k fetální genové expresi je řízen prostřednictvím hypoxií indukovaného faktoru (HIF). Prostřednictvím unikátního ex vivo zvířecího modelu a mnoha in vitro buněčných modelů jsme prokázali, že 1 % hypoxie a stabilizace HIF jsou klíčovým předpokladem ke změnám v expresi MHC (Myh6, Myh7). Přímá interakce HIF-1α s vazebnými místy v genech kódujících MHC nebyla potvrzena, proto byly dále zkoumány jiné, na HIF-1α a hypoxii závislé mechanismy regulace. Z našich výsledků vyplývá, že významnou roli v regulaci exprese MHC hraje signalizace dráhy mTOR a antisense RNA a dlouhá nekódujíci RNA molekula. Jeden z nejslibnějších přístupů v léčbě poškozeného srdce představuje využití kmenových buněk. Ty mohou přispět k obnovení srdeční činnosti doplněním nových funkčních buněk. Diferenciace kmenových buněk, včetně embryonálních kmenových buněk (ESC), je ovlivněna hypoxií, a prohloubení našich znalostí v této oblasti tak může přispět k efektivnějšímu využití kmenových buněk v cílených terapiích. V této práci jsme se zaměřili na vliv hypoxie a stabilizace proteinu HIF indukované inhibitory prolinových hydroxyláz (PHD) na spontánní diferenciaci ESC. Hypoxie i oba testované inhibitory významně zvyšovaly HIF-1α a HIF-2α na proteinové úrovni a vedly k zvýšené transkripční aktivitě proteinu HIF. Současně docházelo k podstatnému snížení buněčné proliferace, která se projevovala úplnou zástavou syntézy DNA a částečným zastavením buněčného cyklu v S fázi. Stabilizace HIF byla doprovázená poklesem hladiny pluripotentních znaků (OCT4, NANOG, ZFP-42, TNAP). K poklesu však současně docházelo i u znaků souvisejících s diferenciací jako jsou SOX1, BRACH a ELF5. Krátkodobá kultivace v hypoxii či stabilizace HIF prostřednictvím inhibitorů PHD tudíž nezabraňuje spontánní ztrátě pluripotence u myších ESC. Závěrem lze shrnout, že předkládaná práci potvrzuje klíčovou úlohu hypoxie v regeneraci srdce a odhaluje specifickou roli HIF-1α v potenciální terapii srdečních onemocnění.

Abstract:

The adult mammalian heart is generally considered to carry only small regenerative potential. As a consequence, cardiovascular diseases are the number one cause of death worldwide. The presented thesis thus aims to deepen the understanding of the regulation mechanisms leading to potential enhancement of the heart regeneration capacity. Particularly, the study focuses on the possible role of hypoxia in the modulation of these mechanisms. In various pathophysiological conditions the adult mammalian heart retains the ability to return to the fetal gene program. This is commonly associated with changes in the gene expression of myosin heavy chains (MHCs), the key motor proteins of the heart muscle. We propose a hypothesis that hypoxia, a condition common for the fetal and failing heart, plays an important role in the regulation of MHCs gene expression and thus potentially, also in the return of the fetal gene program and that it is most likely mediated by the hypoxia inducible factor (HIF). A unique ex vivo animal model and various in vitro cellular models were employed in order to eventually show that hypoxia (1 % O2) and subsequent stabilization of protein HIF-1α are key regulatory conditions, which significantly contribute to the modulation of MHCs (Myh6, Myh7) gene expression. Since we did not confirm the direct interaction of HIF-1α with proposed HIF response elements (HREs) located in MHCs encoding DNA region, we further analyzed other HIF-1α-dependent and hypoxia-associated mechanisms. This resulted in a revelation of the significant role of mTOR signaling and antisense RNA and long noncoding RNA molecule in the regulation of MHCs gene expression. One of the promising therapeutic approaches for the treatment of the damaged heart is the use of stem cells as a source of new cells for the heart repair. Interestingly, hypoxic conditions are suggested to affect the differentiation status of stem cells, including embryonic stem cells (ESC) and thus may be an important tool in protocols employing ESC for therapeutic use. In this study we therefore aimed to address the impact of hypoxia and pharmacological stabilization of HIF by prolyl hydroxylase inhibitors on spontaneous mouse ESC (mESC) differentiation. Hypoxia and both tested inhibitors significantly increased HIF-1α and HIF-2α protein levels and HIF transcriptional activity. This was accompanied by significant downregulation of cell proliferation manifested by the complete inhibition of DNA synthesis and partial arrest in the S phase. HIF stabilization enhanced downregulation of the expressions of some pluripotency markers (OCT4, NANOG, ZPF-42, TNAP). However, at the same time, expression of some markers of cell differentiation (e.g. SOX1, BRACH T, ELF5) significantly decreased. Thus, the short term stabilization of HIF-mediated by the PHD inhibitors and hypoxia did not prevent the spontaneous loss of pluripotency markers in mESC. In conclusion, the presented study endorses hypoxia as a key component in heart regeneration and moreover unveils the potential specific role of HIF-1α as an important target molecule in the treatment of heart damage.

Keywords

hypoxia, HIF, heart development, myosin heavy chain, embryonic stem cells, hypoxie, vývoj srdce, těžký řetězec myosinu, embryonální kmenové buňky

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 3. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 1. 4. 2016
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.
• Reader: prof. MUDr. Kateřina Kaňková, Ph.D., Igor Adameyko, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology