Vývoj kultivační metody lidských embryonálních kmenových buněk s využitím autologních fibroblastů

Bc. Kamil Matulka, Ph.D.

Diplomová práce

Development of culture method for hESCs using autologous fibroblasts

Anotace:

hES buňky mají schopnost neomezené proliferace in vitro a mohou diferencovat do všech buněčných typů. Díky těmto vlastnostem by se mohly stát zdrojem pro regenerativní medicínu a buněčné transplantace. Než k tomu však dojde, je nutno vyřešit podmínky kultivace, které jsou v současné době pro klinické aplikace nevhodné. Kultivační prostředí hES buněk je z části tvořeno nedefinovanými složkami živočišného původu a existují rizika pro potenciální příjemce terapie. Kultivační systém závislý na podpůrných fibroblastech xenogenního nebo allogenního původu představuje pro hES buňky riziko kontaminace virovými patogeny. Živočišné komponenty média mohou vyvolat silnou odezvu imunitního systému. Z těchto důvodů je nutné nahradit cizorodé složky kultivačního prostředí hES buněk klinicky přijatelnějšími alternativami. Ve této práci jsem se zabýval vývojem kultivační metody hES buněk s využitím autologních fibroblastů, které jsem derivoval dvěma metodami. Stanovil jsem fenotyp hES buněk kultivovaných na podpůrné vrstvě autologních fibroblastů a analyzoval jsem produkci růstových faktorů ovlivňujících nediferencovaný růst hES buněk, které tyto fibroblasty produkují. Zjistil jsem, že existují velké rozdíly mezi autologními fibroblasty derivovanými stejnými metodami. Pravděpodobně je to dáno tím, že podmínky, ve kterých jsou tyto buňky derivovány, nejsou zcela definované. Dále jsem zjistil, že produkce růstových faktorů se mezi získanými liniemi výrazně liší. Jedna z linií produkuje značné množství Activinu A, čehož bych mohl využít za jistých podmínek pro diferenciaci hES buněk do definitivního entodermu. Pokračování této práce bude spočívat v derivaci autologních fibroblastů z různých linií hES buněk. Rovněž bych se chtěl pokusit o získání autologních fibroblastů v médiu obsahujícím lidské sérum, což by byl krok vedoucí ke klinické použitelnosti těchto podpůrných buněk.

Abstract:

Human embryonic stem cells (hESCs) possess an ability to proliferate indefinitely and to differentiate into any cell types of human body. These features confer them the capability to be a source of differentiated cells for cell replacement therapies. However, it is necessary to resolve culture conditions first, because present state is unsuitable for clinical applications. These conditions involve undefined components of animal origin and therefore present a risk for recipients of a therapy. A feeder-dependent culture represents a risk of contamination of hESCs by xenogeneic or allogeneic pathogens and immunogenic substances that may induce a host vs. graft reaction. This certainly hampers potential of hESCs for cell-based therapies. In my diploma thesis I developed a culture method involving autologous feeder-layer, derived by two different methods. I analyzed a phenotype of hESCs cultured on a feeder composed of such fibroblasts and assayed a production of growth factors related to undifferentiated growth of hESCs. I showed that there are differences among autologous feeders obtained by similar methods, which could be associated to undefined conditions of derivation. Subsequently, I found significant variations in amounts of growth factors produced by these cells. Further prospects of my work might be in deriving autologous feeders from multiple lineages of hESCs and in medium containing human serum. That approach could be significant for acquiring hESC applicability in human cell based therapies.

Klíčová slova

Lidské embryonální kmenové buňky, růstové faktory, autologní fibroblasty, kondiciované médium, human embryonic stem cells, growth factors, autologous feeder, conditioned media

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2008

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 17. 6. 2008
• Vedoucí: prof. Ing. Petr Dvořák, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární biologie a genetika