Zastoupení a funkční význam rostlinných polyfenolů za různých radiačních podmínek

Mgr. Jakub NEZVAL

Doctoral thesis

Qualitative composition and function of plant polyphenols under the different radiation conditions

Abstract:

Tato práce je zaměřena na studium vlivu světla, konkrétně jeho spektrální kvality a celkové ozářenosti, na metabolismus rostlinných fenolických látek (FL). Cílem je posouzení dopadů světlem indukovaných změn metabolického profilu FL na míru tolerance rostlin vůči působení světelného stresu. FL mohou navyšovat toleranci rostlin vůči tomuto stresovému faktoru dvěma hlavními mechanismy. Prvním je schopnost pohlcovat ultrafialové záření (UV) předtím, než může proniknout do hlubších vrstev listu. Druhým je schopnost účinně likvidovat reaktivní formy kyslíku (ROS) a omezovat jejich vznik. Jak UV-B (280 ? 315 nm) záření, tak ROS, mohou poškozovat DNA, proteiny i lipidy přítomné v rostlinných buňkách. Velmi citlivé vůči působní UV-B a ROS jsou pigmentproteinové komplexy zapojené ve světelné fázi fotosyntézy (zejména fotosystém II - PSII) a enzymy účastnící se Calvinova cyklu (např. RuBisCO). Studium stavu fotosyntetického aparátu je tedy vhodným postupem pro sledování rozsahu světlem indukovaného poškození. Velmi podstatnou částí této práce je zavedení nových metodik umožňujících kvalitativní a kvantitativní analýzu FL v rostlinném materiálu. Hlavní modelovou rostlinou využívanou v rámci provedených (eko)fyziologických studií byl ječmen jarní (Hordeum vulgare L. cv. Bonus a cv. Barke). Při optimalizaci analytických metod byly využity i rostliny jahodníku obecného (Fragaria vesca L.). Pro posouzení kvalitativního a kvantitativního složení volných FL obsažených v listech zmíněných rostlinných druhů bylo využito především metod vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) ve spojení s optickým absorpčním detektorem typu diodového pole (DAD) a hmotnostním detektorem (typu Q-TOF). Nově zavedené metodiky HPLC-DAD(-MS) umožnily efektivnější a úspornější analýzu vzorků ve srovnání s dříve používanou metodikou HPLC-DAD. Čas separace byl zkrácen na 1/3 a spotřeba mobilních fází klesla přibližně 9x. FL byly přesněji identifikovány na základě MS a MS2 spekter, ne pouze s využitím spekter absorpčních. Výsledky studia metabolického profilu FL vedou k závěru, že nejcitlivěji reagují na změnu radiačních podmínek B-dihydroxylované flavonoidy (např. lutonarin). Jejich relativní množství, vzhledem k flavonoidům B-monohydroxylovaným (např. apigeninu) je zvyšováno jak vysokou ozářenosti fotosynteticky aktivní radiace (FAR), tak UV-B a to se synergickým účinkem. Jelikož B-dihydroxylované flavonoidy vykazují větší antioxidační aktivitu než flavonoidy B-monohydroxylované, lze chápat sledovanou odezvu rostlin jako snahu omezit oxidativní poškození zvýšenou produkcí nízkomolekulárních antioxidantů. Výsledky také naznačují, že za tento druh odezvy na vysokou ozářenost FAR je zodpovědná především jeho modrá složka, přičemž lze předpokládat zapojení kryptochromů v tomto regulačním procesu. Zatímco obsah FL s antioxidační funkcí rychle reflektuje změny radiačních podmínek, epidermální UV stínění listů si zachovává stejnou úroveň i po odeznění světelného stresu. Pre-aklimace rostlin na vysoké ozářenosti FAR (případně FAR a UV) tak zvyšuje odolnost listů vůči pronikání UV-B po dobu několika dnů. Výsledky uvedené v této práci vypovídají o důležité roli FAR a UV při zvyšování odolnosti rostlin vůči působení akutního světelného stresu, zejména ochraně fotosyntetického aparátu.

Abstract:

In this thesis, the effect of light spectral quality and total irradiance on the composition of plant phenolic compounds (PC) is evaluated. The aim of this study is to find out to which extent may be the plant tolerance to unfavourable light conditions affected by light-induced changes in PC content. PC participate in the photoprotection by their ability to effectively absorb the ultraviolet radiation (UV) and due to their ability to scavenge reactive oxygen species. Both, excessive UV-B radiation (280 ? 315 nm) and high concentration of ROS are able to significantly damage DNA, proteins and lipids which are vital for plant cells. Pigment-protein complexes involved in the light phase of photosynthesis (such as photosystem II) and enzymes which take a part in CO2 assimilation (such as RuBisCO) are good examples of molecules sensitive to UV-B and ROS induced damage, thus the assessment of the functional state of photosynthesis is suitable method for the determination of plant tolerance to stress caused by the excessive light. Important part of this work is dealing with the development of analytical procedures allowing the identification and quantification of PC in plant material. As a model plant in presented (eco)physiological studies, spring barley (Hordeum vulgare L. cv. Bonus and cv. Barke) was used. For the optimization of analytical procedures, we used plants of wild strawberry (Fragaria vesca L.) as well. The identification and quantification of soluble PC was performed using high performance liquid chromatography (HPLC) systems equipped with diode array detector (DAD) or DAD and mass spectrometer (Q-TOF type). The developed HPLC-DAD(-MS) procedures allowed more effective and cost-saving analysis of PC compared to HPLC-DAD method we used before. The separation time was reduced to one third and the consumption of mobile phases was lowered approximately 9x compared to older method. PC contained in the plant material were identified on the basis of their exact molecular mass and fragmentation patterns (not only based on the comparison of absorption spectra as it was done before). The analysis of PC metabolic profile revealed that B-dihydroxylated flavonoids such as lutonarin are very sensitive to changes of radiation conditions. Under the high irradiance of photosynthetically active radiation (PAR) or UV-B their content increased significantly compared to the content of B-monohydroxylated flavonoids (such as dominant flavonoid saponarin). Since B-dihydroxylated flavonoids are considered to be stronger antioxidant than B-monohydroxylated flavonoids, observed response indicated, that plants favoured the synthesis of B-dihydroxylated flavonoids during light-induced stress to reduce potential oxidative damage. It seems that for this kind of response induced by high irradiance of PAR the blue spectral component is responsible (the involvement of cryptochromes in this process is expected). Whereas the content of antioxidative PC sensitively responded to change of radiation conditions, the epidermal UV shielding remained stable once induced by excessive light. Thus the pre-acclimation of plants to high irradiance of PAR (or PAR + UV) may increase the tolerance of plants to excessive UV-B for several days. Presented results indicate the importance of PAR and UV for the induction of plant tolerance against acute light stress and particularly for the protection of light sensitive photosynthetic apparatus.

Keywords

fotosynteticky aktivní radiace (FAR), ultrafialové záření, spektrální složení světla, fotoreceptory, světlem indukovaný stres, fenolické látky, flavonoidy, reaktivní formy kyslíku, vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC), hmotnostní spektrometrie, epidermální UV stínění

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 7. 2016

Thesis defence

• Supervisor: doc. RNDr. Jiří Kalina, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Applied Physics / Biofyzika