Development of artificial tissues for disease modelling - application of tissue engineering methods

Mgr. Zuzana Garlíková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Abstrakt Úvod. Extracelulární hmota (ECM) definuje fyzikální vlastnosti tkání a utváří mikroprostředí buněk, regulujíc adhezi, proliferaci, diferenciaci a migraci buněk. Naším cílem bylo izolovat ECM z plicní tkáně, určit její proteomické složení, charakterizovat její 3D strukturu a popsat její interakci s primárními buňkami plic s využitím in vitro kultivační platformy. Lidské embryonální kmenové buňky (hESC) jsou schopné diferencovat se do širokého spektra buněčných typů, což činí z hESC atraktivní nástroj pro in vitro modelování chorob a buněčnou terapii. Naším cílem bylo vyvinout protokol pro diferenciaci hESC do buněk distálního plicního epitelu a stanovit jejich histomorfogenetický potenciál při kultivaci na rozhraní médium-vzduch (ALI). Metody. ECM plic byla generována pomocí metody decelularizace plicní tkáně. Molekulární charakterizace ECM byla stanovena pomocí histochemie, imunofluorescence a hmotnostní spektrometrie. Morfologie ECM plic byla vizualizována pomocí elektronové mikroskopie. Ke zkoumání aktivity ECM v kontaktu s buňkami byla ECM mechanicky homogenizována nebo ponechána v nativní formě a použita jako 3D kultivační podklad. Účinek ECM na proliferaci buněk byl kvantifikován za použití vysokokapacitní mikroskopie a softwaru Cell Profiler. K vizualizaci interakce buněk s 3D podkladem byla použita konfokální mikroskopie. Výsledky. Proces decelularizace účinně odstranil buňky z plicní tkáně, zatímco ECM zůstala zachována. Homogenizovaná ECM plic použitá jako doplněk kultivačního média neměla vliv na proliferaci plicních fibroblastů in vitro, zatímco homogenizovaná ECM použitá k ošetření kultivačního povrchu podpořila adhezi plicních fibroblastů. Byla vytvořena in vitro kultivační platforma pro vizualizaci interakce buněk s ECM pomocí konfokální mikroskopie. Fibroblasty izolované z plicní tkáně kolonizovaly 3D ECM v nativní formě, exprimovaly ECM remodelující enzymy a translokovaly YAP protein v kontaktu s ECM. Byl zaveden protokol pro diferenciaci hESC do buněk distálního plicního epitelia. Diferencované buňky exprimovaly endodermální marker SOX17 a plicní epiteliální markery TTF1, SPA, pro-SPB a CCSP. V kultuře ALI buňky vytvořily apikobazálně polarizovaný epitel. Závěr. Vyvinuli jsme protokol pro efektivní decelularizaci myší plicní tkáně. Byla charakterizována struktura a složení ECM plic. Vytvořili jsme 3D in vitro kultivační platformu, na níž byla popsána interakce buněk s ECM. Vyvinuli jsme protokol pro diferenciaci hESC do buněk exprimujících molekulární znaky buněk distálního plicního epitelia.

Abstract:

Abstract Introduction. Extracellular matrix (ECM) shapes the physical properties of tissues and forms the cell microenvironment, modulating cell adhesion, proliferation, differentiation and migration. We aimed to isolate ECM from lung tissue, determine its proteomic composition, characterize its 3D structure, and study its interaction with primary lung cells in in vitro cultivation platform. Human embryonic stem cells (hESCs) are able to differentiate into a broad spectrum of cell types, which makes hESCs an attractive tool for in vitro disease modelling and cell therapy. We aimed to develop a protocol for differentiation of hESCs into cells of distal lung epithelium and determine their histomorphogenetic potential in air-liquid interface culture (ALI). Methods. Lung ECM was generated by lung tissue decellularization. Molecular characterization of ECM was determined by histochemistry, immunofluorescence, and mass spectrometry. Morphology of lung ECM was visualized by means of electron microscopy. To study the activity of ECM in contact with the cells the ECM was either mechanically homogenized or left intact and used as 3D scaffold. The impact of ECM on cell adhesion was determined by crystal violet assay. The effect of ECM on cell proliferation was detected using DAPI and EdU nuclear staining and quantified using high-throughput microscopy and Cell Profiler software. Confocal microscopy was used to visualize the interaction of cells with 3D scaffold. Results. Process of decellularization effectively removed cells from the lung tissue while the ECM components remained in the ECM scaffold. Homogenized ECM used as media supplement did not affect proliferation of lung fibroblast in vitro, whereas the homogenized lung ECM used as coating supported the adhesion of lung fibroblasts. An in vitro culture platform for confocal visualization of cell-ECM was established. Lung fibroblasts colonised the 3D lung ECM scaffold, expressed ECM remodelling enzymes and translocated YAP protein when in contact with the ECM scaffold. A protocol for hESCs differentiation into distal lung epithelial cells was established. The differentiated cells expressed endodermal marker SOX17, and lung epithelial markers TTF1, SPA, pro-SPB and CCSP. In ALI culture the cells form apico-basally polarized epithelium. Conclusion. We developed a protocol for effective decellularization of mouse lung tissue. The structure and composition of lung ECM was characterized. We set up a 3D in vitro culture platform, on which the cell-ECM interactions were studied. We also developed a protocol for differentiation of hESCs to cells expressing distal lung epithelial markers.

Keywords

Extracelulární hmota, decelularizace, lidské embryonální kmenové buňky, plicní tkáň, epitel, in vitro diferenciace, extracellular matrix, decellularization, human embryonic stem cells, lung tissue, epithelium, in vitro differentiation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 11. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 6. 12. 2017
• Supervisor: doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Anatomy, Histology and Embryology (4-years) / Anatomy, Histology and Embryology